Exonucleasa VII

La exonucleasa VII es una enzima dirigida de una sola cadena estricta con actividades de exonucleasa de 5'→3' y 3'→5', lo que la convierte en la única exonucleasa bidireccional con especificidad de una sola cadena. La exonucleasa VII no tiene un requisito aparente de cationes divalentes, ya que está completamente activa en presencia de EDTA. Los productos de reacción inicial son oligonucleótidos insolubles en ácido que se hidrolizan en forma soluble en ácido. Los productos de digestiones limitadas son oligómeros pequeños (dímeros a dodecámeros).

Propiedades:
Peso molecular: subunidad xseA = 51,8 kDa; subunidad xseB = 8,8 kDa
Temperatura óptima: 37 °C
pH óptimo: 8,0
Desactivación: 95 °C para 10 min.

Pureza:
Superior al 95 % puro según lo determinado por SDS-PAGE. Se ha sometido a pruebas de contaminación por endonucleasas exonucleasa bicatenarias y ribonucleasas.

Tampón de almacenamiento:
50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM de NaCl, 0,5 mM de EDTA, 10 mM de DTT, 50 % de glicerol.

Condiciones del ensayo:
La reacción (50 µl) contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,9), 50 mM de fosfato potásico (pH 7,6), 8,3 mM de EDTA, 10 mM de 2-mercaptoetanol, ADN desnaturalizado y enzima.

Definición de la unidad:
Una unidad es la cantidad de enzima necesaria para catalizar la conversión de 1 nmol de nucleótido a nucleótido soluble en ácido en 30 min a 37 °C en condiciones de ensayo estándar.

Concentración:
10 unidades/µl

Fuente:
Cepa E. coli que contiene clones sobreproductores que codifican las subunidades grandes (Xsea) y pequeñas (xseB) de exonucleasa VII

Protocolo: Condiciones de reacción típicas (50 µl)
70 mM de Tris-HCI, pH 8,0
8 mM de EDTA
10 mM de 2-mercaptoetanol
1 µg de ADN
50 µg/ml
0,2 unidades de exonucleasa VII

Incube a 37 °C durante 30 min. Inactive la enzima calentando a 95 °C durante 10 min. Tenga en cuenta que la exonucleasa VII no está inhibida por la EDTA.

Nota: Un tampón de dilución típico para su uso con exonuclease VII consiste en 50 mM de Tris, pH 7,9, 1 mM de DTT y 0,5 mg/ml de BSA acetilada.

Aplicaciones:
  1. Asignación de las posiciones de los intrones en el ADN genómico.
  2. Extracción del ADN vectorial de insertos con colas poli (da-T).
  3. Extracción del exceso de cebadores de PCR.
  4. Extracción de los extremos monocatenarios producidos por endonucleasas de restricción.