El kit de enriquecimiento de lisosomas Thermo Scientific™ para tejidos y células de cultivo permite el aislamiento y enriquecimiento de lisosomas intactos a partir de extractos de células y tejidos crudos. El kit proporciona suficientes reactivos para preparar 25 extractos y utiliza medios de separación celular OptiPrep para la separación basada en la densidad de lisososomas de estructuras celulares contaminantes. Los lisosomas aislados pueden usarse para una serie de aplicaciones posteriores, incluido 2D/MS para investigación proteómica, microscopía electrónica, perfiles de enfermedades y expresión génica, transducción de señales e interacción o localización.

Características del kit de enriquecimiento del lisosomas para tejidos y células cultivadas:

• Eficaz y fácil de usar: los reactivos y la centrifugación de gradiente del kit separan los orgánulos de las estructuras contaminantes
• Compatible: prepare muestras para aplicaciones posteriores (incluidas 2D/MS), microscopía electrónica, perfil de enfermedades, expresión de genes, transducción de señales y estudios de interacción o localización
• Completo: los kits contienen materiales en cantidad suficiente para realizar 25 aplicaciones

Este kit permite el enriquecimiento de orgánulos intactos a partir de células y tejidos. Cada kit utiliza la centrifugación de gradiente de densidad para separar los orgánulos de las estructuras celulares contaminantes. Los orgánulos aislados pueden utilizarse para una serie de aplicaciones posteriores, como 2D/MS, microscopía electrónica, perfiles de enfermedades, expresión génica, transducción de señales y estudios de interacción o localización.

Enriquecimiento de orgánulos a partir de tejido:
Ratas Sprague-Dawley de seis a ocho semanas de edad con un peso promedio de 160 g se mantuvieron en ayuno durante la noche antes del sacrificio. Se extirparon el hígado y los riñones, lavaron con PBS helado, picaron con tijeras quirúrgicas y luego se homogeneizaron en el reactivo A helado con un accesorio de tejido Polytron™ durante 45 segundos a 8000 r.p.m. Posteriormente se añadió el reactivo B y se centrifugó el homogeneizado para eliminar los residuos celulares. El sobrenadante resultante se superpone en un gradiente discontinuo de los medios de separación celular OptiPrep™ y se centrifuga para aislar y enriquecer el orgánulo diana. La banda diana se retiró del gradiente y se analizó por Western blot.

Enriquecimiento de orgánulos a partir de células:
Se examinaron varias líneas celulares para determinar el aislamiento de lisosomas: A431 [American Type Culture Collection (ATCC™ Resource Center), n.º CRL-1555], HeLa (ATCC, n.º CCL-2) y HepG2 Cells (ATCC, n.º HB-8065). Las células se cultivaron a 90-80 % de confluencia. Se cosechó aproximadamente 50-200 mg de pasta celular húmeda y se procesó para el enriquecimiento del lisososoma. Se añadió a las células el reactivo A de lisosomas helado y se realizó la lisis utilizando un homogeneizador ultrasónico 3000 Misonix con 15 pulsos que suministran 15 W de potencia.

Posteriormente, se añadió el reactivo B de lisosomas y se centrifugó el homogeneizado para eliminar los residuos celulares. El sobrenadante resultante se superpuso en varios gradientes discontinuos de los medios de separación celular OptiPrep y se centrifugó para aislar y enriquecer el orgánulo diana. La banda diana se eliminó del gradiente y, junto con el lisado total, se normalizó por cantidad de proteínas (a menos que se indique lo contrario) y se analizó mediante Western blot.

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