Sistema de expresión de ARNi lentiviral BLOCK-iT™ Pol II miR con EmGFP

El sistema de expresión ARNi miR Pol II BLOCK-iT™ con EmGFP combina las tecnologías ARNi miR Pol II BLOCK-iT™ Invitrogen y lentivirales ViraPower™ para facilitarla creación de un lentivirus incompetente en la replicación que suministra una secuencia de microARN(miRNA) de interés para células que se dividen o no se dividen de mamíferos para el análisis de interferencia de ARN (RNAi), ensanchando así las posibles aplicaciones de RNAi más allá de las de otros sistemas retrovirales tradicionales (Naldini, 1998). El sistema de expresión ARNi miR Pol II Lentiviral BLOCK-iT™ con EmGFP incluye: o Un kit de vector de expresión ARNi miR Pol II BLOCK-iT™ para la producción de un clon de expresión que contiene un oligonucleótido de doble cadena que codifica una secuencia premiARN para la expresión en células de mamíferos. El vector de expresión ARNi - miR Pol II BLOCK-iT™ (pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR) proporciona una manera rápida y eficiente de clonar los dúplex de ds oligo que codifican una secuencia diana deseada de miARN en un vector que contiene un promotor Pol II (CMV) para su uso en el análisis de ARNi. El vector de expresión ARNi miR Pol II BLOCK-iT™ está diseñado específicamente para permitir la expresión de secuencias de miARN y contener secuencias específicas de miR que flanquean y permiten el procesamiento adecuado del miARN. o Expresión cocistrónica de un indicador de Emerald GFP (EmGFP) en el vector pcDNA™6.2-GW/EmGFP-Mir, resultando en una correlación muy fuerte de la expresión de EmGFP con la actividad de reducción de su miARN o El vector pDONR™221 para transferir el casete de expresión de premiARN al plásmido de expresión lentiviral usando tecnología Gateway™. La tecnología Gateway™ es un método de clonación universal que aprovecha las propiedades de recombinación específicas del sitio del bacteriófago lambda (Landy, 1989) para proporcionar una manera rápida y altamente eficiente de mover su secuencia de ADN de interés en múltiples sistemas de vectores. o Un vector de destino pLenti6/V5-DEST en el que el casete premiARN del clon de expresión se transfiere utilizando tecnología Gateway™.Este plásmido de expresión contiene elementos que permiten el empaquetado de la construcción en viriones y el marcador de resistencia a la blasticidina para la selección de líneas celulares transducidas de manera estable. o Las mezclas de enzimas BP y LR Clonase™ II Gateway™ facilitan la transferencia del casete de expresión premiARN del vector de expresión al vector de destinopLenti6/V5-DEST. o Componentes del sistema lentiviral ViraPower™ para la producción de un lentivirus incompetente en la replicación que expresa de manera estable el miARN de interés tanto en las células de mamíferos que se dividen como en las que no se dividen. La tecnología lentiviral ViraPower™ facilita la administración altamente eficiente, in vitro o in vivo de un gen o ARN diana a células de mamíferos con y sin división mediante un lentivirus incompetente en la replicación. Basado en el sistema lentikat™ desarrollado por Cell Genesys (Dull et al., 1998), la tecnología lentiviral ViraPower™ posee características que mejoran su bioseguridad al tiempo que permite una expresión de alto nivel en una gama más amplia de tipos de células que los sistemas retrovirales tradicionales.