Premo Autophagy Assays with Sensor LC3B, p62, or Tandem Sensor RFP-GFP-LC3B

Supervise fácilmente diversas etapas de autofagia celular con los ensayos y sensores de autofagia Premo, que se basan en quimeras de proteínas fluorescentes ligadas a LC3B o p62, o el sensor en tándem RFP-GFP-LC3B. Los kits de ensayo de autofagia Premo ofrecen la selectividad de los sensores de autofagia Premo, que se basan en quimeras de proteínas asociadas a la autofagia LC3B o p62, y proteínas fluorescentes verdes (GFP) y/o rojas (RFP), con la eficacia de la transducción de la tecnología BacMam. La transducción o incluso la cotransducción se pueden realizar en una amplia variedad de células, incluidas las neuronas y las células madre neuronales (NSC) mediante un protocolo sencillo que implica la adición del reactivo quimérico BacMam 2.0 a las células, la incubación durante la noche y, a continuación, la visualización de la transducción mediante ajustes estándar de GFP (proteína fluorescente verde) y/o RFP (proteína fluorescente roja).

Los sensores de autofagia Premo aprovechan las proteínas asociadas a la autofagia LC3B o p62, junto con GFP o RFP, para detectar la inducción o inhibición de la autofagia en las células. Los sensores de autofagia Premo se transducen mediante la tecnología BacMam (baculovirus de insectos con un promotor mamífero), lo que permite una visualización inequívoca de las proteínas quiméricas en autofagosomas. Los reactivos BacMam no se replican en células de mamíferos y, por lo tanto, son seguros para su manipulación. También son no citotóxicos y están listos para usar. A diferencia de los vectores de expresión habituales, los reactivos BacMam habilitan la expresión titulable y reproducible y ofrecen una alta eficacia de cotransducción, por lo tanto, se pueden usar con facilidad varios reactivos BacMam en las mismas células. Las recientes mejoras realizadas en el sistema BacMam permiten una transducción eficaz en una mayor variedad de células, incluidas las neuronas y las células madre neurales (NSC), con un protocolo sencillo de un solo paso. Para visualizar la autofagia, basta con añadir el sensor de autofagia BacMam a las células e incubar durante la noche para la expresión de proteínas y, a continuación, detectar la señal mediante los ajustes de fluorescencia de GFP y/o RFP estándar del instrumento.

La proteína LC3B desempeña un papel fundamental en la autofagia. Normalmente, esta proteína reside en el citosol, pero después de la escisión y la lipidación con fosfatidiletanolamina, LC3B se asocia con el fagóforo. Esta localización se puede utilizar como marcador general para membranas autofágicas. La proteína p62, también conocida como secuestosoma (SQSTM1), es una proteína de unión a la ubitiquitina que funciona como un receptor de los cargamentos destinados a ser degradados por la maquinaria autofágica celular. Cuando se induce la autofagia, la proteína p62 se localiza en los autofagosomas y posteriormente se degrada. Por el contrario, con la inhibición de la autofagia, la proteína p62 se acumula en el autofagosoma. Así, la localización subcelular de una quimera de proteína p62-fluorescente sirve como un marcador útil para la inducción e inhibición de la autofagia.

Además, al combinar la GFP sensible al ácido (es decir, Emerald GFP) con una RFP no sensible al ácido (es decir, TagRFP) en el sensor en tándem RFP-GFP-LC3B, el cambio de un autofagosoma (pH neutro) al autolisosoma (con un pH ácido) se puede visualizar obteniendo la imagen de la pérdida específica de la fluorescencia de la GFP tras la acidificación del autofagosoma después de la fusión lisosomal. Tras la inducción de la autofagia, el sensor de autofagia en tándem Premo etiqueta los autofagosomas puntuados; estas estructuras son positivas tanto para la GFP como para la RFP. Una vez que el lisosoma se ha fusionado, el pH cae, lo que elimina la GFP, haciendo que los autolisosomas aparezcan en rojo. Además, al combinar el sensor de autofagia en tándem Premo con el sensor de luz rojo lejano LysoTracker Deep Red (disponible por separado), se permite un análisis de tres colores de la dinámica autofagosómica/autolisosómica/lisosómica.

Cada kit de ensayo de autofagia Premo incluye difosfato de cloroquina, que se utiliza como control negativo para inhibir la autofagia.

Ventajas de utilizar ensayos de autofagia Premo
• Inspirado por multiplexing: al combinar el sensor de autofagia en tándem Premo con el sensor de emisión rojo lejano LysoTracker Deep Red, se permite un análisis de tres colores de la dinámica de la ruta de la autofagia completa.
• Sistema de entrega altamente eficaz: más del 90 % de la transducción de una amplia gama de líneas de células de mamíferos, incluidas las células primarias, las células madre y las neuronas.
• Rápido y práctico: simplemente añada el reactivo de autofagia Premo a sus células, déjelas incubar durante la noche y obtenga la imagen o almacene las células congeladas preparadas para el ensayo para su uso posterior.
• Resistente: los reactivos de autofagia Premo no se replican en células de mamíferos, no tienen ningún efecto citopático observable y son adecuados para protocolos con el nivel de bioseguridad (BSL) 1.
• Múltiples configuraciones: — los sensores de autofagia Premo están disponibles en las siguientes configuraciones quiméricas:
P36235: LC3B-GFP; LC3B (G120A)-GFP de control; P36236: LC3B-RFP; LC3B (G120A)-RFP de control; P36239: RFP-GFP-LC3B; P36240: GFP-p62; P36241: RFP-p62