Easy-Titer™ Human IgG (H+L) Assay Kit

El kit de ensayo de IgG de humano Thermo Scientific Easy-Titer incluye microesferas sensibilizadas con anticuerpos para medir la concentración específica de anticuerpos mediante una técnica de microaglutinación fácil y rápida mediante microplacas estándar y un lector de placas UV-Vis (espectrofotómetro). Este kit es específico para la IgG de humano y, a diferencia de los ensayos de proteínas totales, puede medir específicamente la concentración de anticuerpos diana en muestras (p. ej., suero, plasma, sobrenadante de cultivos) que contienen otras proteínas. Es sensible y requiere volúmenes de muestra muy pequeños. La concentración de anticuerpos viene determinada por la respuesta al análisis (absorbencia) mediante la comparación con una curva estándar preparada a partir de diluciones de una muestra de anticuerpo conocida (vendida por separado).

Características generales de los kits de ensayo de anticuerpos Easy-Titer:

• Especificidad basada en anticuerpos: permite medir la concentración de anticuerpos diana en una muestra, no solo la proteína total; además, no es necesario purificar el anticuerpo para evaluar su concentración.
• Más rápido y fácil que el método ELISA: ensayo homogéneo de tres componentes; tiempo de incubación total de 10 minutos.
• No se necesita ningún equipo especial: se emplea un mezclador vórtex estándar, una pipeta, una microplaca de 96 pocillos, un agitador de placas y un lector (la absorbancia debe medirse a 340 nm o 400 nm).
• Sensible: intervalo de ensayo (curva estándar) de 8 a 500 ng/ml; utilice la muestra de 15 a 300 ng/ml para obtener resultados óptimos.
• Reproducible: coeficiente de variación del 5 % <; los errores dependerán de la técnica de dilución y pipeteo.
• Estándares de anticuerpos que se venden por separado: utilice cualquier estándar de anticuerpos con la identidad de diana adecuada y una concentración conocida (superior a 10 µg/ml).
• Kits para los cinco elementos diana más empleados: seleccione un kit específico para la inmunoglobulina de una especie y clase concretas; evite las reacciones cruzadas con otras especies y clases del anticuerpo diana.

Los kits de ensayo Easy-Titer detectan y miden anticuerpos diana específicos mediante la aglutinación de microesferas recubiertas («sensibilizadas») con anticuerpos policlonales anti-IgG o IgM específicos. En el tampón acuoso adecuado (suministrado con el kit), las microesferas monodispersas recubiertas de anticuerpos (con un diámetro de >1 µm) tienen el coeficiente de absorción más alto (λ-máx.) de la luz incidente, con una longitud de onda (340 nm) que equivale aproximadamente a la mitad de su diámetro. Cuando se añade la muestra, dos o más microesferas se unen a cada anticuerpo diana a través de sus anticuerpos policlonales específicos recubiertos, y esta aglutinación en esferas aparentemente más grandes da lugar a una disminución proporcional de la absortividad (menor absorbancia).

Los ensayos convencionales de microaglutinación dependen de un cambio en la dispersión de la luz y el correspondiente cambio en la transmitancia, con la que la absorbancia está inversamente relacionada. Los kits de análisis Easy-Titer utilizan un tampón de dilución especial cuyo índice de refracción elimina el efecto de la dispersión de la luz en las microesferas monodispersas para la longitud de onda de medición empleada. Por ello, la dilución final de 10 a 20 veces de la muestra que se va a utilizar en el análisis debe realizarse con el tampón de dilución suministrado con el kit.

Los ensayos con anticuerpos Easy-Titer son más rápidos y fáciles que los del método ELISA:
• Prepare los estándares (de 5 a 500 ng/ml); para ello, diluya el anticuerpo purificado en el tampón de dilución del kit.
• Prepare las muestras: dilúyalas en el tampón de dilución hasta que estén dentro del rango del ensayo (de 8 a 500 ng/ml).
• Agite el vial con gránulos de microesferas para crear una suspensión homogénea.
• Con una pipeta, añada 20 µl de suspensión de gránulos y 20 µl de cada muestra y estándar en los pocillos de la microplaca de 96 pocillos.
• Incube la microplaca durante 5 minutos y mezcle enérgicamente.
• Añada 100 µl del reactivo de bloqueo del kit.
• Incube la microplaca durante 5 minutos y mezcle enérgicamente.
• Mida la absorbancia en un lector de placas convencional (340 nm o 405 nm).
• Trace la curva estándar e interpole las muestras para determinar la concentración.

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