TaqMan™ Fast Cells-to-C_T™ Kit

El kit Fast Cells-to-C_T™ TaqMan™ hace posible el uso de instrumentación y química de PCR en tiempo real de ciclo rápido para realizar análisis de expresión génica directamente a partir de células cultivadas sin purificación de ARN.

El kit Fast Cells-to-C_T TaqMan™ es:

• El flujo de trabajo completamente optimizado incluye reactivos de lisis celular con eliminación de ADNg, una mezcla de enzimas de RT, un tampón y una mezcla maestra de expresión génica TaqMan™
• Preparación de muestras rápida en 7 minutos, incluido el tratamiento con ADNasa, a temperatura ambiente; la mezcla maestra para PCR universal TaqMan™ Fast proporciona resultados de PCR en tiempo real en ∼35 minutos
• Muestras fáciles de lisar en un tubo o directamente en placas de cultivo de 96 o 384 pocillos
• Análisis de expresión génica de ejecución sólida en 10-100 000 células por muestra, con resultados equivalentes a los del ARN purificado
• Eficaz: contiene reactivos suficientes para generar 500 resultados de PCR en tiempo real a partir de 100 muestras iniciales

Solución completa y validada
La tecnología Cells-to-C_T™ TaqMan™ es un método único para lisar células cultivadas, a la vez que elimina el ADN genómico (ADNg) y preserva la integridad del ARN. Además, el kit contiene reactivos de transcripción inversa (RT) y la mezcla maestra para PCR universal rápida TaqMan™ para el análisis de PCR en tiempo real rápido, y se ha probado y validado ampliamente con los ensayos de expresión génica TaqMan™ de referencia, que se venden por separado. Todos los componentes del kit se han optimizado para funcionar juntos para un rendimiento consistente y fiable, lo que elimina las conjeturas que implica el montaje de kits independientes para la preparación de muestras, la transcripción inversa y la PCR rápida en tiempo real.

Flujo de trabajo rápido y cómodo
El kit Fast Cells-to-C_T™ TaqMan™ incorpora un procedimiento de preparación de muestras de 7 minutos (ver figura) para usar con 10-100.000 células de cultivo en tubos directamente o en placas de cultivo de 96 o 384 pocillos. Las células se lavan en PBS, a continuación, se lisan durante 5 minutos a temperatura ambiente; el tratamiento de ADNasa opcional se puede realizar de forma simultánea. Para finalizar la lisis, las células se deben someter a un proceso de incubación de 2 minutos con solución de parada a temperatura ambiente. El kit simplifica en gran medida un proceso tradicionalmente laborioso y lo reduce a 7 minutos.

Los lisados ya están preparados para la transcripción inversa con el sistema de RT optimizado incluido en el kit, o pueden almacenarse a -20 °C durante un máximo de 5 meses, para análisis futuros. La mezcla maestra para PCR universal rápida TaqMan™ suministrada proporciona resultados sensibles y reproducibles aproximadamente 3 veces más rápidos que los reactivos e instrumentos de PCR estándar. La combinación de una preparación de muestras rápida y sencilla y los resultados de PCR en tiempo real de ciclo rápido (∼35 minutos) permite una cuantificación más rápida de objetivos genéticos que la disponible anteriormente. El flujo de trabajo del kit Fast Cells-to-C_T™ TaqMan™ reduce el tiempo desde la muestra hasta el resultado un 40 % o más, en comparación con la purificación de ARN tradicional y la PCR en tiempo real estándar.

Resultados sólidos, sensibles y confiables
El análisis de expresión génica precisos en una amplia gama de entrada de muestras para genes con varios niveles de expresión ha sido tradicionalmente un desafío para los investigadores. Por lo tanto, una solución sólida es importante para generar perfiles de ARN de unas pocas o muchas células. Se muestra la demostración de la excelente linealidad de la señal (R2 = 0,997) observada usando lisados del kit Fast Cells-to-C_T™ TaqMan™ en 5 registros de entrada celular (10–10⁵ células por reacción de lisis; ver figura). Por lo tanto, se puede usar un solo kit para el análisis de la expresión génica de muestras limitadas o densas, sin comprometer la integridad de los datos causada por los inhibidores de la PCR.

El rendimiento de la PCR de los lisados celulares con el kit Fast Cells-to-C_T™ TaqMan™ fue equivalente al del ARN purificado, con la mezcla maestra para PCR universal rápida TaqMan™ suministrada (consulte la figura). Tanto los lisados del kit TaqMan™ Cells-to-C_T™ como el ARN purificado mostraron una detección lineal en un rango de cinco logaritmos de equivalentes de entrada de células. La sensibilidad mejorada en la entrada de diez células con los lisados del kit TaqMan™ Fast Cells-to-C_T™ en comparación con el ARN purificado, utilizando los mismos reactivos RT y PCR, resulta de una retención más eficaz de moléculas objetivo durante la preparación, es decir, sin pérdida de ARN normalmente asociada con la transferencia o el calentamiento de muestras.

El kit TaqMan™ Fast Cells-to-C_T™ también demostró un rendimiento superior en comparación con el ARN transcrito de forma inversa y amplificado por PCR con el RT y la fórmula maestra rápida de Competitor Q’s. El rango dinámico observado utilizando los reactivos de Competitor Q’s con ciclado rápido fue de 10² a 10⁵ equivalentes celulares, es decir, 1 logaritmo menos que los lisados del kit TaqMan™ Cells-to-C_T™ o el ARN purificado amplificado con la fórmula maestra rápida de PCR universal TaqMan™ (véase la figura). La mezcla maestra rápida de PCR universal TaqMan™ está formulada para ofrecer resultados sensibles y reproducibles más rápido de lo posible con reactivos e instrumentos estándar, y es sólida en una amplia gama de genes y concentraciones objetivo.