Descripción:
el ADN polimerasa Sequenase™ Versión 2.0 es una forma genéticamente modificada de ADN polimerasa de T7. A diferencia de la enzima natural, prácticamente no tiene actividad exonucleasa 3’→5'. La versión 2.0 de Sequenase es altamente procesiva, incorpora análogos de nucleótidos (dlTP, tio-dNTPs, dideoxi-NTPs, etc.), no se ve obstaculizada por estructuras secundarias y puede realizar síntesis de desplazamiento de cadena. Es una enzima excelente para la secuenciación didesoxi y es útil en otras aplicaciones, especialmente donde es deseable la ausencia de actividad de exonucleasa asociada.

La versión 2.0 de la Sequenasa tiene dos subunidades, una es la proteína de E. coli tioredoxina (peso molecular 12 000) y la otra es una versión de ingeniería genética de la proteína 5 del gen T7 del bacteriófago (peso molecular 76 000). Los cambios genéticos en esta subunidad (una eliminación de 28 aminoácidos lograda por mutagénesis in vitro) eliminan toda actividad de exonucleasa medible sin cambiar la actividad de la ADN polimerasa.

Propiedades:
Peso molecular: Consta de dos subunidades, proteína 5 del gen T7 modificada (76 kDa) y tioredoxina de E. coli
(12 kDa)
pH óptimo: 7,5
Temperatura óptima: 37 °C
Requisitos para el catión divalente: Mg2⁺, Mn2⁺

Pureza:
pureza superior al 95 %, según lo determinado por SDS-PAGE. Se ha probado para contaminar endonucleasas y exonucleasas de doble y de cadena única.

Tampón de almacenamiento:
20 mM de fosfato de potasio (pH 7,4), 1 mM de DTT, 0,1 mM de EDTA, 50 % de glicerol.

Condiciones del ensayo:
la mezcla de reacción (100 μl) contiene 40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,3 mM dNTP y 5 μg M13mp18 precocido a 5 pmol M13, cebador universal. La enzima se agrega a la mezcla de reacción precalentada (37 °C) la incubación es a 37 °C durante 1 min.

Definición de unidad:
una unidad de enzima cataliza la incorporación de 1 nmol de nucleótido en forma insoluble en ácido en 30 segundos a 37 °C.

Concentración:
13 unidades/μl

Prueba funcional:
secuenciación de ADN con la versión 2.0 del kit de secuenciación de ADN (PN 70770).

Tampón de reacción Sequenase 5X probado funcionalmente (1 ml incluido, PN 70702):
200 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM MgCl₂, 250 mM NaCl

Tampón de dilución Sequenase (1 ml incluido, PN 70765):
10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA.

Referencias:
Tabor, S. and Richardson, C. C. (1989) J. Biol. Chem. 264, 6447-6458.
Wang, D., Coscoy, L., Zylberberg, M., Avila, P. C., Boushey, H. A., Ganem, D. and DeRisi, J. L. (2002) Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99, 15687-15692.
Paris, M. (1992) Comments 18, (No. 3), United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio.
Tabor, S. and Richardson, C. C. (1987) Proc.Natl. Acad Sci. USA 84, 4767-4771.
Tabor, S. and Richardson, C. C. (1989) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86, 4076-4080.