Bac-to-Bac™ HBM TOPO™ Secreted Expression System

La expresión de baculovirus Bac-to-Bac es un método eficaz para producir baculovirus para la expresión de proteínas de alto nivelMás información

Número de catálogo	Cantidad
A11339	20 reacciones

Número de catálogo A11339

Precio (CLP)

Cantidad:

20 reacciones

La expresión de baculovirus Bac-to-Bac es un método eficaz para producir baculovirus para la expresión de proteínas de alto nivel en células de insectos. Se basa en la generación de virus recombinante por la transposición específica del sitio en E. coli en lugar de una recombinación homóloga en células de insectos. El sistema de expresión pFastBac HBM TOPO incluye:

• Expresión de proteínas secretadas: el vector Bac-to-Bac HBM TOPO contiene la señal de secreción de melitina de abeja (HBM) para permitir la expresión de proteínas secretadas. Debido a que las glicoproteínas no pueden ser glicosiladas en ausencia de una señal de secreción, este vector se recomienda para la expresión de glicoproteínas.

• Flexibilidad: el vector Bac-to-Bac HBM TOPO contiene una etiqueta His con extremo C-terminal con un sitio de escisión TEV para facilitar la purificación de proteínas etiquetadas con His con resinas quelantes de níquel (como el sistema de purificación Invitrogen ProBond) y la generación de proteínas nativas con la ayuda de la proteasa Invitrogen AcTEV.

• Clonación rápida y fácil detección: la tecnología de clonación Blunt TOPO permite la clonación de productos de PCR de extremo romo en el vector pFastBac TOPO en cinco minutos. Además, el kit de expresión pFastBac TOPO se suministra con E. coli Mach1-T1R que permite la visualización de colonias ocho horas después de la exposición en placas selectivas de ampicilina debido a su tiempo de duplicación más rápido en comparación con otras cepas de clonación estándar. Obtenga más información sobre las ventajas de la clonación TOPO ›

• Alta eficacia de transfección con el reactivo de transfección ExpiFectamine SF: los kits de expresión TOPO Bac-to-Bac ahora incluyen la última generación de reactivos de transfección ExpiFectamine SF para una transfección de ADN eficaz en células de insectos mediante protocolos rápidos y flexibles. Obtenga más información sobre este reactivo ›

• Bacmid de expresión que ahorra tiempo: con el sistema Bac-to-Bac, el casete de expresión del vector pFastBac se recombina con el bacmid precursor en las células competentes de E. coli DH10Bac para formar un bacmid de expresión. A continuación, el bacmid se transfecta en células de insectos para producir partículas recombinantes de baculovirus.

• Fácil detección de colonias: el bacmid en la E. coli DH10Bac contiene un segmento del gen lacZa. El gen lacZa se interrumpe tras la transposición del casete de expresión en el bacilo, lo que permite la selección azul/blanca de recombinantes para facilitar la identificación de colonias recombinantes.

• Alta expresión de proteínas: el vector pFastBac utiliza el potente promotor de poliedrina para generar altos niveles de expresión en una variedad de líneas celulares de insectos como Sf9, Sf21 y células High Five.

Para uso exclusivo en investigación. No apto para uso en procedimientos diagnósticos.

Especificaciones

Método de clonaciónBlunt TOPO™

Mecanismo de expresiónExpresión basada en células

Línea de productosBAC-to-Bac, TOPO

Etiqueta de proteínaEtiqueta His (6x)

Cantidad20 reacciones

Agente de selección (eucariótico)Ninguno

Sistema de expresiónBaculovirus

PromotorPoliedrina

TipoSistema de expresión secretada

Unit SizeEach

Contenido y almacenamiento

Sistema de expresión secretada Bac-to-Bac HBM TOPO:
• Kit de vectores para 20 reacciones de clonación TOPO, almacenar a - 20 °C
   –pVector FastBac/HBM-TOPO que contiene el sitio de escisión TEV del terminal C y la etiqueta His
   –Plásmido de control pFastBac 1-Gus (vector de expresión de control)
   –Otros reactivos del kit: 10X PCR, mezcla de dNTP, solución salina, agua estéril, plantilla de control PCR, primer directo de poliedrina, primer inverso SV40 pA
• E. coli químicamente competente One Shot Mach1-T1R para 20 reacciones (20 x 50 μl), almacenar a - 80 °C
• E. coli competente MAX Efficiency DH10 para 20 reacciones (4 kits con 5 x 0,1 ml cada uno), almacenar a - 80 °C
• Reactivo de transfección ExpiFectamine SF (1 ml), almacenar a 4 °C, no congelar

Preguntas frecuentes

I cannot grow this white colony in liquid culture. What should I do?

The concentration of gentamicin might be too high. Try lowering the amount to 5 µg/mL and try adding more of the colony to the culture medium.

What has happened when I see blue colonies? How about colonies which are blue in the center and white on the edges?

In the case of a blue colony, the E. coli has the bacmid and the plasmid in it, allowing the cells to survive the selection process. However, because the transposition has not occurred, the LacZ gene is not disrupted. For bulls-eye colonies, this indicates that the transposition took place when the colony was growing. Re-streaking for an isolated clone from the white portion of the mixed colony should yield some colonies where transposition occurred.

I'm getting mostly white/wild-type plaques instead of blue/recombinant plaques. What am I doing wrong?

This is typically an indication of poor homologous recombination. Check the plasmid/linear DNA ratio you used. If there are some blue plaques, however, expand those viruses and check for their protein. In our experience, they are correct, even if they were in relatively low abundance.

I've infected my cells and see large polyhedra in one cell and smaller polyhedra (more numerous) in a neighboring cell. Is this normal?

Yes, cells are infected with wild-type virus individually and will develop polyhedra at different rates until all the cells in the flask are infected. The polyhedra in cells will form in approximately 3-4 days, differing in size and number until they reach their maximum capacity and burst the cell, releasing tiny particles of virus into the medium.

I'm worried that I am not getting plaques. How many days does it take to see plaques and what size are they typically?

Normally, very small white dots show up about 5-7 days and 1 mm plaques show up around day 10. Plaques can vary in size from 1 mm to 4 mm.

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