Oncomine Lung Cell-Free Total Nucleic Acid Research Assay

El ensayo de investigación Oncomine Lung cfTNA forma parte de una solución completa para detectar ADN y ARN (ácido nucleico total libre de células; cfTNA) sin células derivados de tumores pulmonares aislados de la fracción plasmática de sangre completa. Proporciona los reactivos para la construcción de bibliotecas y un solo grupo de cebadores de PCR multiplex para la preparación de bibliotecas de amplicones a partir de cfTNA obtenido a partir de la fracción plasmática de un solo tubo de 10 ml de sangre completa.

Las biopsias líquidas ofrecen varias ventajas sobre las biopsias convencionales de tumores sólidos:
• Menos invasivos, lo que les permite tomarlos en varios puntos de tiempo para monitorizar la progresión del cáncer.
• Menor coste
• Tiempos de respuesta más rápidos, de las muestras a los resultados
• Mejor representación de la heterogeneidad del tumor

El ensayo de investigación Oncomine Lung cfTNA permite el análisis de:
• Genes de áreas de foco (SNV) e indeles cortos: ALK, BRAF, EGFR, ERBB2, KRAS, MAP2K1, MET, NRAS, PIK3CA, ROS1 y TP53 (∼168 áreas de foco cubiertas)
• Fusiones de genes: Omisión de exón 14 ALK, RET, ROS1
• MET
• Gen de número de copia (CNV): MET

Estos genes se han identificado como mutados frecuentemente en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Mediante el uso de la tecnología de secuenciación de etiquetas, se pueden alcanzar límites bajos de detección (LdD) para diferentes tipos de variantes*:
• Para SNV/indeles cortos, se puede conseguir un LdD del 0,1 % con una sensibilidad de ∼90 % y una especificidad de >99 %
• Para fusiones y omisión de exón MET, se puede conseguir un LdD del 1 % con una sensibilidad de >90 % y una especificidad de >99 %
• Para el objetivo MET CNV, se puede conseguir una detección tan baja como una amplificación de 1,2 veces con una sensibilidad de >90 % y una especificidad de >99 %

Todo el flujo de trabajo, desde el aislamiento de cfTNA con el kit de aislamiento de ácido nucleico total sin células MagMAX hasta el análisis de muestras, se puede conseguir en solo dos días con el sistema de secuenciación Ion S5 XL.

Tecnología
cfDNA y cfRNA se encuentran en concentraciones extremadamente bajas en la fracción plasmática de sangre completa. Debido a esta baja prevalencia, en este ensayo se utiliza una tecnología de secuenciación de etiquetas. La tecnología adjunta etiquetas moleculares únicas a los cebadores específicos de genes (figura siguiente). Después de la amplificación, las moléculas etiquetadas se agrupan en función de las etiquetas. Los grupos que contengan la misma variante mutante el 80 % del tiempo o más se denominarán positivos. Mediante la tecnología Tag, se eliminan los grupos que contienen errores aleatorios generados a través del proceso de creación/secuenciación de la bibliografía.

A diferencia de otras tecnologías con LdD del 1 a 5 %, el ensayo de investigación Oncomine Lung cfTNA tiene un límite de detección flexible hasta el 0,1 % para SNV o una copia mutante en un fondo de 1000 copias de tipo natural. Para lograr un LdD del 0,1 %, se requieren 20 ng de cfDNA de entrada. Se pueden usar cantidades menores de cfTNA, pero el %LdD será mayor dependiendo de la cantidad de entrada.

Ventajas:
• El diseño de amplicón optimizado para cfDNA corto garantiza la mayor tasa de captura posible
• La tecnología de secuenciación de etiquetas minimiza los falsos positivos al eliminar los errores incorporados aleatoriamente
• El diseño de ensayo dirigido optimizado permite la secuenciación de próxima generación (NGS) altamente multiplexada, lo que reduce los costes de
secuenciación por muestra
• Flujo de trabajo eficiente de 2 días

El análisis de SNV e indeles cortos se puede conseguir utilizando el software Torrent Suite 5.2 o superior. Para analizar SNV, indeles cortos, fusión y CNV, se requiere Ion Reporter 5.6 (basado en la nube o en el servidor).

Simplicidad, velocidad y capacidad de ampliación de la tecnología de secuenciación de etiquetas
El ensayo de investigación Oncomine Lung cfTNA permite estudios genéticos del cáncer a partir de solo 5 ng de cfTNA de entrada para la creación de bibliografías específicas. El ensayo de investigación Oncomine Lung cfTNA es compatible con muestras FFPE para posibles estudios de concordancia. El tiempo total para las bibliotecas objetivo es de solo cuatro horas. La capacidad de ampliación y la flexibilidad se logran con el conjunto de códigos de barras de secuenciación de etiquetas 1-24 o 25-48 (n.º de cat. A31830, A31847) para el multiplexing de muestras con códigos de barras en chips Ion S5.

*La sensibilidad y la especificidad para cada tipo de variante se determinaron utilizando una colección de muestras positivas artificiales y cfTNA aislado de donantes sanos normales.