El ensayo sin células Oncomine Pan-Cancer forma parte de una solución completa para detectar múltiples objetivos en ARN y ADN derivado de tumor aislados de la fracción plasmática de sangre completa. El ensayo proporciona los reactivos y una sola agrupación de cebadores de PCR multiplex para la preparación de una biblioteca de amplicones a partir del ácido nucleico total libre de células (cfTNA) obtenido a partir de la fracción plasmática de un solo tubo de 10 ml de sangre completa. Esta biblioteca se puede utilizar para secuenciación de última generación (NGS) dirigida de alta multiplexación.

Ventajas del ensayo sin células Oncomine:
• A partir de un solo tubo de sangre, genera una biblioteca de amplicones tanto a partir de ADN como de ARN con un límite de detección del 0,1 % para los SNV
• Tamaño de amplicón optimizado para cfDNA corto, garantizando la máxima velocidad de captura posible
• La tecnología de secuenciación de etiquetas minimiza los falsos positivos al eliminar los errores incorporados aleatoriamente
• El diseño de ensayo dirigido optimizado permite la NGS altamente multiplexada, lo que reduce los costes de secuenciación por muestra
• Flujo de trabajo de dos días a partir de un solo tubo de sangre de 10 ml hasta el informe; el tiempo total para las bibliotecas dirigidas es de tan solo cuatro horas
• Permite realizar estudios genéticos de cáncer desde solo 5 ng de cfTNA de entrada
• Compatible con muestras de FFPE para posibles estudios de concordancia

El panel de 52 genes incluye:
• Genes de áreas de foco (SNV) e indeles cortos: AKT1, ALK, AR, ARAF, BRAF, CHEK2, CTNNB1, DDR2,EGFR, ERBB2, ERBB3, ESR1, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FLT3, GNA11, GNAQ, GNAS, HRAS, IDH1, IDH2, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MTOR, NRAS, NTRK1, NTRK3, PDGFRA, PIK3CA, RAF1, RET, ROS1, SF3B1, SMAD4, SMO
• Fusiones génicas: ALK, BRAF, ERG, ETV1, FGFR1, FGFR2, FGFR3, MET, NTRK1, NTRK3, RET, ROS1
• Omisión de MET exon 14 omitir
• Genes de número de copias (CNV): CCND1, CCND2, CCND3, CDK4, CDK6, EGFR, ERBB2, FGFR1, FGFR2, FGFR3, MET, MYC
• Genes supresores de tumores: APC, FBXW7, PTEN, TP53

Se ha identificado que estos genes mutan con frecuencia en varios tipos de cáncer, entre los que se incluyen los de vejiga, cerebro y SNC, mama, cuello uterino, colorrectal, endometrial, esofágico, gástrico, de cabeza y cuello, de riñón, hígado, pulmón, melanoma, ovario, pancreático, de próstata, sarcoma y tiroides.

Límites de detección:
• SNV/indeles cortos: se puede alcanzar un límite de detección (LOD) de hasta 0,1 % de frecuencia de alelos (AF) con una sensibilidad >80 % y una especificidad de >98 %*
• SNV/indeles de diana completa TP53: AF 0,5 % (mirando todas las bases dentro de los amplicones)
• Fusiones y omisión del exón MET: se puede alcanzar un LOD de hasta el 1 %
• Objetivos de CNV: se puede lograr una detección tan baja como un cambio de 1,4 veces

Es muy recomendable el kit de aislamiento de ácido nucleico total libre de células MagMAX (A36716) para el aislamiento de ADN y ARN de la fracción plasmática de sangre completa.

La escalabilidad y la flexibilidad se logran con el conjunto de códigos de barras de secuenciación de etiquetas 1-24 o 25-48 (n.º de cat. A31830 y A31847 respectivamente) para muestras de códigos de barras de multiplexing en los chips Ion S5.

El análisis de los SNV y los indeles cortos se puede realizar con Torrent Suite Software 5.2 o superior. Para analizar SNV, indeles cortos, fusiones y CNV, se requiere Ion Reporter Software 5.6 (basado en la nube o en servidor).

Tecnología
El cfDNA y el cfRNA se encuentran en concentraciones extremadamente bajas en la fracción plasmática de sangre completa. Debido a esta baja prevalencia, en este ensayo se utiliza una tecnología de secuenciación de etiquetas. La tecnología une etiquetas moleculares únicas a los cebadores específicos de genes. Después de la amplificación, las moléculas etiquetadas se agrupan en función de las etiquetas. Los grupos que contengan la misma variante mutante el 80 % del tiempo o más se denominarán positivos. Con esta tecnología de etiquetas, se eliminan los grupos que contienen errores aleatorios generados durante el proceso de secuenciación/construcción de bibliotecas.

A diferencia de otras tecnologías con LOD de 1-5 %, el ensayo sin células Oncomine Pan-Cancer tiene un límite de detección flexible de hasta 0,1 % para los SNV o 1 copia mutante en un fondo de 1000 copias de tipo natural. Para lograr un LOD del 0,1 %, se requieren 20 ng de cfDNA de entrada. Se pueden utilizar cantidades más bajas de cfTNA, pero el % de LOD será mayor en función de la cantidad de entrada.

Las biopsias líquidas ofrecen varias ventajas sobre las biopsias convencionales de tumores sólidos:
• las muestras de biopsia líquida son menos invasivas, lo que permite tomarlas en varios puntos temporales para controlar la progresión del cáncer
• Menor coste en comparación con las biopsias de tejidos tradicionales
• Tiempo de obtención de respuesta más rápido desde la muestra a los resultados
• Mejor representación de la heterogeneidad del tumor

*La sensibilidad y la especificidad de cada tipo de variante se determinaron mediante una recogida de muestras positivas y cfTNA aislado de donantes sanos normales.