El kit de ensayo de citometría de flujo Click-iT™ Plus EdU Alexa Fluor™ 488 proporciona un ensayo simplificado y más sólido para analizar la replicación de ADN en las células proliferantes en comparación con los métodos de BrdU tradicionales. El ADN recién sintetizado se analiza mediante el láser de 488 nm del citómetro de flujo. La formulación Click-iT™ Plus es compatible con fluoróforos estándar, incluido los tándems R-PE y R-PE, así como con proteínas fluorescentes.

• Multiplexable: compatible con R-PE (y tándems) y proteínas fluorescentes
• Precisa: resultados superiores en comparación con ensayos BrdU
• Rápida: resultados en tan solo 60 minutos

Consulte la guía de selección para todos los ensayos de EdU Click-iT™ y EdU Click-iT™ Plus para citometría de flujo.

Multiplexable
La formulación Click-iT™ Plus proporciona una capacidad de multiplexing mejorada en comparación con los ensayos originales de citrometría de flujo Click-iT™ EdU. Los ensayos Click-iT™ Plus EdU se pueden usar junto con los tándems R-PE y R-PE, además de con proteínas fluorescentes como GFP y mCherry, sin pérdida de precisión o velocidad con respecto al ensayo Click-iT™ EdU original.

Un método avanzado que ofrece resultados superiores a BrdU
El método más preciso de análisis de proliferación es la medición directa de la síntesis del ADN. Originalmente, este procedimiento se realizaba mediante la incorporación de nucleósidos radiactivos. Este método fue reemplazado por la detección basada en anticuerpos del análogo nucleósido bromodesoxiuridina (BrdU). El ensayo de citometría de flujo Click-iT™ Plus EdU es una novedosa alternativa al ensayo de BrdU. EdU (5-etinil-2´-desoxiuridina) es un análogo de la timidina que se incorpora al ADN durante la síntesis de ADN activa. La detección se basa en la química de clic, que es una reacción covalente catalizada con cobre entre una azida y un alquino. En esta aplicación, el alquino se encuentra en la fracción de etinil de EdU, mientras que la azida se acopla al tinte Alexa Fluor™. Se utilizan métodos de citometría de flujo estándar para determinar el porcentaje de células de fase S en la población.

Unas condiciones moderadas permiten el uso con tintes de ciclo celular y anticuerpos
El tamaño reducido de la acida en la tinción permite la detección eficaz de los EdU incorporados utilizando condiciones moderadas, mientras que la fijación basada en aldehído estándar y la permeabilización del detergente son suficientes para que el reactivo de detección Click-iT™ Plus consiga acceso al ADN. Esto ocurre de manera diferente en los ensayos de BrdU donde se requiere la desnaturalización del ADN (mediante HCl, calor o digestión con ADNasa) para exponer la BrdU de forma que pueda detectarla un anticuerpo anti-BrdU. El procesamiento de las muestras para el ensayo de BrdU puede provocar una alteración de la señal de la distribución del ciclo celular, además de la destrucción de los sitios de reconocimiento de los antígenos cuando se utilice el método HCl. Por el contrario, el sencillo ensayo Click-iT™ Plus EdU es compatible con tintes de ciclo celular. El ensayo Click-iT™ Plus EdU también se puede multiplexar con anticuerpos contra la superficie y marcadores intracelulares, así como conjugados marcados con fluoróforos estándar incluidos tándems R-PE, R-PE y proteínas fluorescentes (GFP y mCherry).

Protocolo rápido y sencillo
El protocolo Click-iT™ Plus EdU se basa en los pasos de fijación mediante aldehído y permeabilización de detergente para marcado de anticuerpos inmunohistoquímicos. Sin embargo, EdU es compatible con otros agentes de fijación/permeabilización incluidos el metanol y la saponina. En tan solo cinco pasos podrá empezar a analizar los datos de proliferación celular:

1. Trate las células con EdU.
2. Fije y permeabilice las células.
3. Detecte células de fase S con el cóctel de detección Click-iT™ Plus durante 30 minutos.
4. Lave una vez.
5. Analice.

Los resultados se pueden comprobar en tan solo 60 minutos en algunas circunstancias, pero recomendamos 90 minutos para todas las aplicaciones.