TA Cloning™ Kit, Dual Promoter, with pCR™II Vector, without competent cells
Invitrogen™
TA Cloning™ Kit, Dual Promoter, with pCR™II Vector, without competent cells
El promotor doble del kit TA Cloning™ con vector pCR™II proporciona una estrategia de clonación rápida y de un pasoMás información
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K207040
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Precio (CLP)
684.981
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El promotor doble del kit TA Cloning™ con vector pCR™II proporciona una estrategia de clonación rápida y de un paso para insertar directamente un producto de PCR amplificada con Taq en un vector plasmídico. Los promotores T7 y SP6 del vector pCR™II permiten la transcripción in vitro del inserto para producir productos de sentido o antisentido. El promotor doble del kit TA Cloning usa el vector de clonación pCR™II y ligasa de ADN T4 ExpressLink™ para generar un producto de ligadura en un proceso de ligadura de quince minutos a temperatura ambiente. Las reacciones normalmente producen > 80 % de recombinantes que contienen insertos.
Características del Kit de clonación™ de TA Dual Promoter: • Rápido y cómodo: ligación en 15 minutos a temperatura ambiente • Eficaz: detección azul/blanco y > 80 % de los clones con inserto adecuado • Flexible: elección de resistencia a kanamicina o ampicilina para la selección flexible de antibióticos• Sin complicaciones: elimina cualquier modificación enzimática del producto de PCR • Optimizado: no requiere el uso de primers de PCR que contengan sitios de restricción
El vector pCR™II proporciona: • Salientes 3'-T para ligadura directa de productos de PCR amplificada con Taq • Promotores T7 y SP6 para transcripción y secuenciación de ARN in vitro • Poliligador versátil con sitios EcoR I flanqueados para fácil escisión de insertos • Sitios de primer directo e inverso M13 para secuenciación
Cómo funciona TA Cloning™ La polimerasa Taq tiene un actividad no dependiente de la plantilla que añade una sola deoxiadenosina (A) a los extremos 3' de los productos de PCR. El vector linealizado suministrado en este kit tiene residuos de una sola desoxiadenosina 3' (T). Esto permite a los insertos de PCR ligar de forma eficaz con el vector.
Configuraciones del kit El kit TA Cloning™ se ofrece en una variedad de configuraciones: con E. coli químicamente competente One Shot™ INVF’ (K2050-01 y K2050-40), E. coli químicamente competente One Shot™ TOP10F’ (K2060-01 y K2060-40) y sin células competentes (K2750-20 y K2750-40) en tamaños de kit de 20 y 40 reacciones.
Para uso exclusivo en investigación. No apto para uso en procedimientos diagnósticos.
Especificaciones
Cepa bacteriana o de levaduraNo incluida
Método de clonaciónTA Cloning
Para utilizar con (aplicación)Clonación PCR
N.º de reacciones40 reacciones
Línea de productosTA Cloning
Tipo de productoKit de clonación
PromotorT7, SP6
Cantidad40 rxns
VectorpCRII
FormatoKit
Unit SizeEach
Contenido y almacenamiento
Este kit contiene el vector pCR™II linealizado, la ligasa de ADN T4 ExpressLink™, el tampón de ligación de ADN T4 5X ExpressLink™, dNTPs, el tampón de PCR 10X, agua estéril y controles.
Almacene todos los componentes a - 20 °C. Se garantiza la estabilidad de todos los reactivos durante 6 meses si se almacenan correctamente.
Preguntas frecuentes
How do you recommend that I prepare my DNA for successful electroporation of E. coli?
For best results, DNA used in electroporation must have a very low ionic strength and a high resistance. A high-salt DNA sample may be purified by either ethanol precipitation or dialysis.
The following suggested protocols are for ligation reactions of 20ul. The volumes may be adjusted to suit the amount being prepared.
Purifying DNA by Precipitation: Add 5 to 10 ug of tRNA to a 20ul ligation reaction. Adjust the solution to 2.5 M in ammonium acetate using a 7.5 M ammonium acetate stock solution. Mix well. Add two volumes of 100 % ethanol. Centrifuge at 12,000 x g for 15 min at 4C. Remove the supernatant with a micropipet. Wash the pellet with 60ul of 70% ethanol. Centrifuge at 12,000 x g for 15 min at room temperature. Remove the supernatant with a micropipet. Air dry the pellet. Resuspend the DNA in 0.5X TE buffer [5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA (pH 7.5)] to a concentration of 10 ng/ul of DNA. Use 1 ul per transformation of 20 ul of cell suspension.
Purifying DNA by Microdialysis: Float a Millipore filter, type VS 0.025 um, on a pool of 0.5X TE buffer (or 10% glycerol) in a small plastic container. Place 20ul of the DNA solution as a drop on top of the filter. Incubate at room temperature for several hours. Withdraw the DNA drop from the filter and place it in a polypropylene microcentrifuge tube. Use 1ul of this DNA for each electrotransformation reaction.
Have you compared in vitro transcription levels between SP6 and T7 promoters in your pCRII vectors?
No, we have not done in-house comparisons of transcription levels. It is widely known though that T7 polymerase produces more RNA than SP6 (on the order of 10-fold higher).
When should DMSO, formamide, glycerol and other cosolvents be used in PCR?
Cosolvents may be used when there is a failure of amplification, either because the template contains stable hairpin-loops or the region of amplification is GC-rich. Keep in mind that all of these cosolvents have the effect of lowering enzyme activity, which will decrease amplification yield. For more information see P Landre et al (1995). The use of co-solvents to enhance amplification by the polymerase chain reaction. In: PCR Strategies, edited by MA Innis, DH Gelfand, JJ Sninsky. Academic Press, San Diego, CA, pp. 3-16.
Additionally, when amplifying very long PCR fragments (greater than 5 kb) the use of cosolvents is often recommended to help compensate for the increased melting temperature of these fragments.