pENTR™/SD/D-TOPO™ Cloning Kit, with One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli

Los kits de clonación pENTR™/SD/D-TOPO™ emplean una estrategia de clonación extremadamente eficaz de 5 minutos (clonación TOPO™) para clonar de forma direccional un producto de PCR de extremo romo en un vector para introducirlo en el sistema Gateway™ o el sistema MultiSite Gateway™. Los productos de PCR de extremo romo se clonan de forma direccional en el vector de entrada pENTR™/SD/D-TOPO™ con una eficacia superior al 90 % e incluyen una secuencia de Shine-Dalgarno de flujo ascendente para la expresión en procariotas.

El kit se suministra con todo lo necesario para clonar y seleccionar el gen de interés amplificado de PCR:

• Sistema Gateway™ listo: transporte rápido de los genes clonados entre múltiples sistemas de vectores
• Rápido y fácil: de PCR a Gateway™ en solo tres pasos y en tan solo ∼5 minutos de manipulación
• Eficaz: logra más del 90 % de los clones con el inserto adecuado en la dirección correcta
• Probado: rendimiento fiable durante más de una década

Descripción general de los kits de clonación pENTR™/SD/D-TOPO™

VECTOR	Vector pENTR™/SD/D-TOPO™	Vector de clonación direccional para la entrada al sistema Gateway™ y optimizado para expresión procariota
MÉTODO DE CLONACIÓN	Clonación TOPO™ direccional	Ligación direccional basada en topoisomerasa I de ∼5 minutos entre productos de PCR de corrección con polimerasa amplificada con extremo romo y el vector
CÉLULAS COMPETENTES	Dos opciones	Elija entre kits con células competentes de crecimiento rápido o alta eficacia

Acceso sencillo al sistema Gateway™
Para acceder al sistema Gateway™, amplifique mediante PCR el gen de interés y añada el producto directamente a la topoisomerasa suministrada y cargada en el vector pENTR™/SD/D-TOPO™, realice una incubación de 5 minutos y transforme las células competentes de E. coli suministradas. Los clones de entrada de Gateway™ que contienen attL están listos para someterse a una recombinación eficaz con los vectores de destino Gateway™ seleccionados.

Vector pENTR™/SD/D-TOPO™ optimizado
El vector pENTR™/SD/D-TOPO™ (Figura 1) incluye un potenciador traslacional del gen 10 de T7 y un emplazamiento de unión al ribosomas (RBS) para una expresión óptima de la proteína nativa después de la recombinación con vectores de destino Gateway™ procarióticos. También puede utilizar el vector para la expresión en otros sistemas huéspedes mediante la recombinación con diferentes vectores de destino El vector cuenta con emplazamientos de secuenciación de primers M13 y T7, así como emplazamientos de recombinación de attL que flanquean el emplazamiento del inserto del producto de PCR. Esto permite verificar fácilmente la secuencia de los clones y realizar la recombinación deseada de los vectores de destino Gateway™ que contienen attR. Se emplea un gen de resistencia a kanamicina y un origen de pUC para la selección y la propagación de número de copias alto en E. coli.

Clonación direccional simplificada
Gracias a la tecnología de clonación TOPO™, no hay necesidad de realizar acciones como limpieza de PCR, preparación de vectores u otros pasos de manipulación de ADN que consumen mucho tiempo. Solo tiene que añadir su reacción de PCR directamente al vector cargado con la topoisomerasa suministrado, incubar 5 minutos, transformar y obtener clones insertados de forma direccional en hasta un 90 %. Una protuberancia con cuatro bases de los pares del vector con una secuencia de cuatro bases diseñada en el primer directo empleado en la reacción de PCR para ofrecer direccionalidad a la reacción de ligación de la topoisomerasa (figura 2).

La potencia de la tecnología de clonación de recombinación Gateway™
La tecnología de clonación de recombinación Gateway™ sortea las limitaciones de la clonación con restricciones, lo que le permite tener acceso a prácticamente cualquier sistema de expresión en tan solo una hora, con una reacción de recombinación Gateway™ reversible y eficaz al 99 %. La capacidad para mover la misma secuencia de ADN entre distintos vectores sin el uso de enzimas de restricción, ligasa, pasos de subclonación, detección de innumerables colonias o resecuenciación ayudará a ahorrar tiempo, dinero y esfuerzo.

Principales tecnologías de clonación
En el campo de la clonación, la tecnología de clonación TOPO™ y la tecnología de clonación de recombinación Gateway™ han sido unos socios fiables durante más de diez años para miles de científicos. La clonación TOPO™ y la recombinación Gateway™ resultan rápidas, fáciles de usar y eficaces; además, permiten agilizar la clonación y la posterior transferencia de genes entre una amplia variedad de vectores de expresión Gateway™.

Opciones del kit
El kit de clonación pENTR™/SD/D-TOPO™ se puede adquirir con células competentes TOP10 para una clonación estándar o bien con células competentes Mach1™-T1R para un crecimiento rápido.