Active Rho Pull-Down and Detection Kit

El kit de «pull-down» y detección de Rho activo Thermo Scientific Pierce permite el enriquecimiento selectivo y la detección de Rho GTPasa unida a GTP a través de una interacción específica de proteínas con el dominio de unión de proteínas de Rhotekin.

El kit de «pull-down» y detección de Rho activo incluye dominio de unión de Rho (RBD) GST-Rhotekin purificado, resina de glutatión agarosa, controles positivos y negativos (GTPγS y GDP, respectivamente), tampón de lisis/unión/lavado, anticuerpo anti-Rho, anticuerpo secundario, tampón de muestra, columnas de centrifugado y tubos de recogida. El kit fue validado usando lisados de células NIH 3T3, una línea celular conocida por tener una fuerte actividad Rho.

Características del kit de detección y «pull-down» de Rho activo:

• Gran sensibilidad y precisión: los reactivos optimizados, el anticuerpo anti-Rho pan específico y el procedimiento Western blot garantizan unos controles precisos y resultados semicuantitativos
• Validado: funcionalmente probado para la detección de Rho para garantizar la calidad y el rendimiento
• Compatible: eficaz con una variedad de tipos de células de ratón, rata y fuentes humanas

Aplicaciones:
• Seguimiento de la activación de Rho GTPasa durante la diferenciación celular, la migración, la división y la reordenación citoesquelética
• Estudio de la activación de Rho durante la formación de fibras de estrés
• Supervisión de la actividad de Rho después de la estimulación con factores de crecimiento
• Cribaje de los inhibidores de moléculas pequeñas para ver sus efectos en la actividad de Rho

El kit activo de «pull-down» y detección de Rho se validó para la función y especificidad de Rho activo utilizando lisados celulares tratados con GTPγS para activar el Rho endógeno y se comparó con lisados tratados con GDP para inactivar la pequeña GTPasa. El tratamiento con GTPγS atrapa Rho en la forma ligada al GTP (activo), dando como resultado una señal fuerte cuando está presente el Rho endógeno. El tratamiento del GDP empuja a Rho a un estado de unión al GDP (inactivo), dando como resultado poca o ninguna señal, independientemente de los niveles de proteína Rho. Este kit está optimizado para la detección de Western blot utilizando un anticuerpo secundario conjugado con HRP (incluido) y sustrato quimioluminiscente Thermo Scientific SuperSignal West Pico (disponible por separado, n.° de pieza 34080). El kit contiene suficientes componentes para 30 ensayos de «pull-down».

Los componentes del kit también se pueden utilizar para la tinción inmunofluorescente. Las células neuronales NS-1 se estimularon con NGF para estudiar la distribución espacial del Rho activo usando la proteína GST-RBD y el anticuerpo anti-Rho suministrado en el kit.

Fondo Rho:
La familia GTPasa de Rho tienen muchas funciones celulares, incluyendo la señalización celular, regulación transcripcional y organización del citoesqueleto de actina. Esta familia de GTPasa comprende Rho (RhoA, RhoB y RhoC), Rac (Rac1, Rac2, Rac3 y RhoG), Cdc42 (Cdc42 y G25K), Rnd (Rnd1, Rnd2 y RhoE/Rnd3), RhoBTB y la familia Miro. Estas GTPasa permiten la transducción de señales desde la membrana plasmática al citosol a través de GPCR, tirosina cinasa, citoquinas y receptores de adhesión. La adhesión a la membrana plasmática se logra a través de las modificaciones de lípidos de geranilgeranil en el terminal carboxílico de la proteína. La transducción de señales a través de Rho GTPasa da como resultado la reorganización de la actina en fibras de estrés y la formación de adherencias focales. RhoA se localiza en el citosol y la membrana plasmática, mientras que Rho B se localiza en la membrana plasmática y en las vesículas de la membrana. Al igual que RhoA, RhoC es citosólico, aunque se localiza en regiones perinucleares.

Las GTPasa Rho interactúan con las proteínas GEF, GAP, GDI y efectoras para la transducción de señales. Hay más de 30 GEF de mamíferos para las GTPasa Rho, y cada GEF contiene un dominio de homología DBI para la reacción de intercambio de nucleótidos, un dominio de homología a pleckstrina y dominios específicos adicionales para las interacciones proteína-proteína. Las proteínas Gap Rho aceleran la hidrólisis de GTP, y las proteínas GDI permiten la translocación de las Rho GTPasa entre el citoplasma y la membrana e inhiben el intercambio GDP/GTP por GEF Rho. La interacción entre el GEF y el GDI con Rho y la subunidad Gα es necesaria para la transducción de señales a través de los GPCR. Algunas de las proteínas efector incluyen p160 Rho cinasa, una serina/treonina cinasa implicada en la formación de la fibra de tensión, p140mDia, que desencadena la reorganización del citoesqueleto de actina, y rotequina, una proteína de andamio serina/treonina cinasa que media la señalización para activar NF-κB. Las GTPasas de la familia Rho pueden funcionar agonísticamente durante la señalización celular y antagonistamente durante la diferenciación.

Más datos del producto
• Medir la activación de las pequeñas GTPasas a través de sus efectores descendentes específicos
• Detección y localización de GTPasas activas en la diferenciación celular neuronal