Los pTZ19R/U de Thermo Scientific son fagémidos pequeños de 2862 bp de longitud, construidos mediante la inserción del ADN de la región intergénica f1 del fago (IG) en el pUC19 y la secuencia promotora T7 cerca del MCS del pUC19. Los fagémidos difieren en la orientación de la región clonada f1 IG. Están diseñados para la clonación de ADN, la secuenciación de ADN dideoxi, la mutagénesis in vitro y la transcripción in vitro en un solo sistema. Una cepa huésped que alberga estos fagémidos producirá ADN monocatenario si está superinfectada con el fago auxiliar M13K07.

Aspectos destacados

• Aislado a partir de E coli (dam+, dcm+)
• Más del 90 % en forma superenrollada
• Aislado a partir de E.coli (dam+, dcm-)
• Para secuencia de ADN, análisis de secuencias y creación de mapas consulte la herramienta gratuita en línea REviewer.

Aplicaciones

• Clonación
• Secuenciación de insertos de ADN, transcripción in vitro

Contenido npTZ19R y notas de uso: los fagémidos pTZ19R/U contienen:
• El replicón pMB1 rep responsable de la replicación del fagémido (fuente: plásmido pUC19)
• El gen bla, codificando para la beta-lactamasa, que confiere resistencia a la ampicilina (fuente: plásmido pUC19)
• La región del operón de E. coli lac que contiene un sitio de unión de proteína CAP, promotor P_lac, sitio de unión del represor lac y la parte terminal 5’ del gen lacZ, que codifica el fragmento de la terminación de tipo N de la beta-galactosidasa (fuente: pUC19). Este fragmento permite el cribaje azul/blanco de fagémidos recombinantes de la misma manera que se describe en la sección pUC18/19
• Un promotor T7 se inserta cerca del MCS del pUC19, lo que permite una síntesis in vitro de grandes cantidades de ARN específico
• La región intergénica F1 del fago que porta las secuencias requeridas en cis para la iniciación y terminación de la síntesis de ADN de fago f1 (cadenas positivas y negativas) y para el empaquetamiento del ADN en partículas bacteriófagas

La síntesis de ADN monocatenario (positivo) requiere el gen II codificado por fago, y proteínas V. Se inicia a ori (+) y procede en la dirección indicada. La conversión de cadenas positivas de ADN en ADN bicatenario no requiere ninguno de los genes fagos. La síntesis de ADN se inicia mediante un primer de ARN de 30 nucleótidos sintetizado por la polimerasa de ARN del huésped y comenzando en ori (-).

El mapa muestra enzimas que cortan el ADN de pTZ19R una vez. Las enzimas producidas por Thermo Scientific se muestran en naranja. Las coordenadas se refieren a la posición del primer nucleótido en cada secuencia de reconocimiento.

Las posiciones exactas de los elementos genéticos se muestran en el mapa (codones de terminación incluidos). El gen bla nucleótidos 2732-2664 (cadena complementaria) codifica para un péptido de señal. El polipéptido LacZ correspondiente a la beta-galactosidasa wt y esencial para el cribaje azul/blanco termina en la posición nt 458 (cadena complementaria). Los aminoácidos restantes en el marco de lectura del LacZ están codificados por el ADN f1. La región rep indicada es suficiente para promover la replicación. La replicación del ADN se inicia en la cadena de ADN complementaria, en la posición 1112 (± 1) y procede en la dirección indicada. Los fagémidos y los plásmidos que llevan los replicones pMB1 y ColE1 son incompatibles entre sí, pero son totalmente compatibles con los que llevan el replicón p15A (pACYC177, pACYC184). Los plásmidos derivados de pMB1 pueden amplificarse con cloranfenicol.