LiveBLAzer™ FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM

배경:
GeneBLAzer™ 세포기반 분석법은 음전하 형광 beta-lactamase 기질인 CCF2 및 CCF4의 막투과성 에스테르형(CCF2-AM and CCF4-AM)을 이용합니다. 이런 친지질성 에스테르는 쉽게 세포에 들어가 내인성 cytoplasmic esterases으로 절단되어 신속히 음전하 형태로 바뀌기 때문에 cytosol에 포집됩니다.

GeneBLAzer™ assays 검출은 FRET를 이용합니다. 각 기질에 efficient FRET pair를 이루는 fluorophore 2개로 표지합니다. Beta-lactamase 활성이 없는 상태에서 완전한 CCF2 분자에 coumarin를 여기시켜(409 nm) fluorescein에 FRET가 나타나게 합니다. 이는 518 nm에서 녹색 형광 신호를 방출합니다(그림 1). 그러나 beta-lactamase 활성이 있는 경우에는 CCF2을 절단해 두 dye로 나누어 FRET를 손상시킨 후 coumarin을 409 nm에서 여기시켜 447 nm에서 청색 형광 신호가 나타나게 합니다. 이 청색 신호는 현미경으로 쉽게 관찰할 수 있으며 형광 microplate reader에서 청색 채널 보기로 확대해 검출할 수 있습니다.

CCF2-AM과 CCF4-AM 기질은 GeneBLAzer™ platform에 꼭 필요한 분석 요소입니다. 이런 기질은 flow cytometry와 완전히 호환되어 클론 선택 시간을 빠르게 합니다. 청색 및 녹색 신호의 Ratiometric 분석은 세포 수와 기질 loading 차이로 인한 웰 간 변동성을 줄여주어 높은 Z´-factor 값과 낮은 변동계수(CV)가 구해집니다.

CCF2-AM와 CCF4-AM 는 coumarin moiety와 lactam ring를 잇는 브릿지 결합상의 탄소 2개로 구분됩니다. 둘 다 막투과성 에스테르화된 형으로 온전한 세포 분석에 사용할 수 있습니다. CCF4-AM는 CCF2-AM보다 가용성 특징이 우수해(> 24시간 동안 용해 상태 유지) 스크리닝 어플리케이션에 적합합니다. 또한 FRET 면에서도 CCF4-AM이 좀 더 우수해 CCF2-AM 보다 background 수준이 낮습니다.

CCF2-FA는 AM 버전에서 볼 수 있는 에스테르가 없는 CCF2 기질입니다. CCF2-FA는 탈에스테르화되어 세포용해 어플리케이션, 세포막 투과 loading 및 탈에스테르화 단계에 사용합니다. 세포용해는 세포벽이 있는 세포를 사용하는 어플리케이션에서 많이 사용하는 방법입니다. CCF2-FA을 control 로 사용하여 CCF2-AM과 CCF4-AM에 대한 여기 및 방출 스펙트럼을 얻을 수도 있습니다.