Active Ras Pull-Down and Detection Kit

El kit de «pull-down» y detección de Ras activo Thermo Scientific permite el enriquecimiento selectivo y la detección de Ras GTPasa unida a GTP a través de una interacción específica de proteínas con el dominio de unión de proteínas de Raf1.

El kit de «pull-down» y detección de Ras activo incluye dominio de unión de Ras (RBD) GST-Raf1 purificado, resina de glutatión agarosa, controles positivos y negativos (GTPγS y GDP, respectivamente), tampón de lisis/unión/lavado, anticuerpo anti-Ras, tampón de muestra SDS, columnas de centrifugado y tubos de recogida. El kit fue validado usando lisados de células NIH 3T3, una línea celular conocida por tener una fuerte actividad Ras.

Características del kit de detección y «pull-down» de Ras activo:

• Gran sensibilidad y precisión: los reactivos optimizados, el anticuerpo anti-Ras específico y el procedimiento Western blot garantizan unos controles precisos y resultados semicuantitativos
• Validado: funcionalmente probado para la detección de Ras para garantizar la calidad y el rendimiento
• Compatible: eficaz para una variedad de tipos de células de ratón, rata y fuentes humanas

Aplicaciones:
• Seguimiento de la activación de Ras GTPasa durante la diferenciación celular, la migración, la división y la reordenación citoesquelética
• Estudio de la función del Ras activo en el cáncer y angiogénesis
• Supervisión de la actividad de Ras después de la estimulación con factores de crecimiento
• Cribaje de los inhibidores de moléculas pequeñas para ver sus efectos en la actividad de Ras

El kit activo de «pull-down» y detección de Ras se validó para la función y especificidad del método de enriquecimiento Ras activo utilizando lisados celulares tratados con GTPγS para activar el Ras endógeno y se comparó con lisados tratados con GDP para inactivar la pequeña GTPasa. El tratamiento con GTPγS atrapa Ras en la forma activa ligada al GTP, dando como resultado una señal fuerte cuando está presente el Ras endógeno. El tratamiento del GDP empuja a Ras a un estado de unión inactivo al GDP, dando como resultado poca o ninguna señal, independientemente de los niveles de proteína Ras. El kit está optimizado para la detección de Western blot con un anticuerpo secundario conjugado con HRP (IgG de cabra antirratón, n.° de pieza 31430) y el sustrato quimioluminiscente Thermo Scientific SuperSignal West Pico (n.° de pieza 34080). Casa kit contiene suficientes componentes para 30 ensayos de «pull-down».

Los componentes del kit también se pueden utilizar para la tinción inmunofluorescente. Las células neuronales NS-1 se estimularon con NGF para estudiar la distribución espacial del Ras activo usando la proteína GST-RBD y el anticuerpo anti-Ras suministrado en el kit.

Fondo Ras:
La superfamilia Ras de GTPasa, llamada así por el oncogén viral del sarcoma de rata, contiene muchas isoformas Ras, incluyendo K-Ras, H-Ras y N-Ras. Mientras que las tres isoformas se expresan en diferentes niveles en diferentes tipos de células, en general, las mutaciones activadoras de al menos una de estas isoformas están presentes en un ∼ 15 % de todos los cánceres. Las proteínas Ras sirven como iniciadoras de la transducción de señales intracelulares de moléculas extracelulares y se asocian con la membrana plasmática mediante la modificación lipídica y la prenilación de su terminal carboxílico. Estas modificaciones en el terminal carboxílico determinan la localización de Ras en microdominios de membrana distintos, lo que dicta la posterior señalización descendente. Las vías de señalización de los Ras afectan a muchos procesos celulares, como la proliferación, la supervivencia, el tráfico vesicular y la expresión génica.

La señalización a través de Ras es fundamental para muchas respuestas celulares, y la activación de Ras está regulada por varias proteínas GEF y GAP. Las proteínas GEF median la activación de la GTPasa disociando el PIB de los Ras inactivos para permitir la unión de Ras a GTP. Por el contrario, las proteínas GAP inactivan las GTPasa mediante el hidrolizado de GTP a GDP. Ras media la señalización descendente mediante la interacción con proteínas efectoras, incluyendo la cinasa Raf y PI3. Raf1 es una proteína cinasa serina/treonina que forma parte de la vía de señalización de la cinasa MAP que conduce a la activación de ERK y p38, que influye en la proliferación y la supervivencia. La señalización de la cinasa PI3 da como resultado la activación de AKT y mTOR, que son centrales para el crecimiento y la supervivencia celular. La Ras también participa en la diferenciación y el desarrollo celulares, incluyendo el desarrollo y la función de las células inmunitarias.

Más datos de producto
• Medir la activación de las GTPasas pequeñas a través de sus efectores posteriores específicos
• Detección y localización de GTPasas activas en la diferenciación celular neuronal