Active Rap1 Pull-Down and Detection Kit

El kit de «pull-down» y detección de Rap1 activo Thermo Scientific Pierce es un kit completo para el enriquecimiento selectivo y la detección de Rap1 GTPasa unida a GTP a través de una interacción específica de proteínas con el dominio de unión de proteínas de RalGDS.

El kit de «pull-down» y detección de Rap1 activo incluye dominio de unión de Rap (RBD) GST-RalGDS purificado, resina de glutatión agarosa, controles positivos y negativos (GTPγS y GDP, respectivamente), tampón de lisis/unión/lavado, anticuerpo anti-Rap1, tampón de muestra, columnas de centrifugado y tubos de recogida. El kit fue validado usando lisados de células NIH 3T3, una línea celular que es conocida por tener una fuerte actividad Rap1.

Características del kit de detección y extracción de Rap1 activo:

• Gran sensibilidad y precisión: los reactivos optimizados, el anticuerpo anti-Rap1 específico y el procedimiento Western blot garantizan unos controles precisos y resultados semicuantitativos
• Validado: funcionalmente probado para la detección de Rap1 para garantizar la calidad y el rendimiento
• Compatible: eficaz con una variedad de tipos de células de ratón, rata y fuentes humanas

Aplicaciones:
• Seguimiento de la activación de Rap1 GTPasa durante la diferenciación celular, la migración, la división y la reordenación citoesquelética
• Estudio de la señalización Rap1 activa en juntas y adhesiones celulares
• Supervisión de la actividad de Cdc24 después de la estimulación con factores de crecimiento
• Cribaje de los inhibidores de moléculas pequeñas para ver sus efectos en la actividad de Rap1

El kit activo de «pull-down» y detección de Rap1 se validó para la función y especificidad del método de enriquecimiento Rap1 activo utilizando lisados celulares tratados con GTPγS para activar el Rap1 endógeno y se comparó con lisados tratados con GDP para inactivar la pequeña GTPasa. El tratamiento con GTPγS atrapa Rap1 en la forma ligada al GTP (activo), dando como resultado una señal fuerte cuando está presente el Rap1 endógeno. El tratamiento del GDP empuja a Rap1 a un estado de unión (inactivo) al GDP, dando como resultado una señal mínima o nula, independientemente de los niveles de proteína Rap1. Este kit se optimizó para la detección de Western blot usando un anticuerpo secundario conjugado con HRP (IgG de cabra anticonejo, n.° de pieza 31460) y el sustrato quimioluminiscente Thermo Scientific SuperSignal West Pico (n.° de pieza 34080). El kit contiene suficientes componentes para 30 ensayos de «pull-down».

Fondo Rap:
Los Rap GTPasa forman parte de la familia Ras de GTPasa y están codificados por Rap1a, Rap1b y Rap2. Los Rap GTPasa son estructuralmente similares a los Ras GTPasa y tienen proteínas activadoras y efectoras similares, aunque los Rap GTPasa tienen actividades funcionales diferentes a los Ras. Mientras que Ras está involucrado en la proliferación y supervivencia celular, Rap1 regula los reordenamiento del citoesqueleto, la adhesión celular y la formación de la unión celular.

La especificidad de Rap1 y Ras está mediada por sus respectivos reguladores y efectores posteriores. Los GEF para Rap contienen un dominio de homología CDC25 que media la reacción de intercambio GDP/GTP y un dominio REM (motivo de intercambio Ras). Algunos GEF para Rap incluyen C3G, Epac1 y 2, RasGRP2, PDZ-GEF1 y 2 y PLCε. El dominio de enlace utilizado en este kit es RalGDS, un GEF que contiene un dominio RA al que Rap1 tiene una mayor afinidad de enlace que Ras. Los RapGAP, incluyendo Rap1GAP y la familia Spa-1, insertan una cadena lateral de asparagina en el bolsillo de unión de nucleótidos para catalizar la reacción de hidrólisis de GTP. Las proteínas de los efectores de Rap, incluyendo RAPL, Riam, AF-6, Krit1, RacGEF, Tiam1, Vav2, Rho GAP y ARAP3, están involucradas en juntas y adhesión celular y, a menudo, se localizan en la membrana o en juntas celulares. Además de Ras, también hay una diafonía entre Rap y Rho GTPasa.

Más datos del producto
• Medición de la activación de las pequeñas GTPasa a través de sus efectores posteriores específicos