El kit Cells-to-C_T™ MicroARN TaqMan™ Ambion™ permite realizar análisis de expresión de microARN (miARN) directamente de las células cultivadas sin necesidad de purificar el ARN. El kit es el primero en ofrecer un flujo de trabajo sencillo y completo para el análisis de expresión de miARN a partir de unas pocas muestras, o puede ser fácilmente incorporado en aplicaciones automatizadas de alto rendimiento.

• Solución completa y validada: el flujo de trabajo optimizado incluye reactivos de lisis celular, ADNasa, reactivos MicroRNA RT TaqMan™ y mezcla maestra de PCR universal TaqMan™
• Preparación rápida, sencilla y práctica: prepare muestras en 10 minutos; elimine el tedioso aislamiento de ARN
• Especificidad de la norma Gold: consiga resultados superiores con los reactivos de microARN TaqMan™
• Rendimiento sólido: resultados equivalentes a ARN purificado
• Rango dinámico de entrada amplia: detección lineal de 10 a 100 000 células

Solución completa y validada

Gracias a un método único para lisiar células cultivadas a la vez que se elimina el ADN genómico y se preserva la integridad del ARN, el kit Cell-to-C_T™ microARN TaqMan™ contiene reactivos de transcripción inversa (RT) de microARN TaqMan™ y la mezcla maestra de PCR universal TaqMan para análisis de PCR en tiempo real. El kit Cells-to-C_T™ MicroRNA de TaqMan™ ha sido ampliamente probado y validado con ensayos de MicroRNA de TaqMan™, que se venden por separado.

Preparación sencilla y cómoda de muestras en 10 minutos

El kit Cells-to-C_T™ MicroRNA TaqMan™ incorpora un procedimiento de preparación de muestras sencillo de 10 minutos (figura 1) para su uso con 10 a 100.000 muestras de células cultivadas, ya sea en placas o tubos. Las células se lavan en PBS y, a continuación, se lisan durante 8 minutos a temperatura ambiente; el tratamiento de ADNasa se puede realizar de forma simultánea. La lisis se termina a temperatura ambiente con una incubación de 2 minutos con solución de parada.

El kit Cells-to-C_T™ MicroRNA de TaqMan™ ya están listos para la transcripción inversa o pueden almacenarse a -20 °C durante un máximo de 5 meses. Dado que las muestras no se someten a un proceso de purificación de ARN, todas las especies de ARN pequeño están disponibles para su análisis. Debido a que las muestras pueden procesarse directamente en placas de cultivo (96 o 384 pocillos), se reduce la manipulación de las muestras y se minimiza el riesgo de pérdida de muestras o error de transferencia. No es necesario calentar, lavar ni centrifugar; el kit simplifica en gran medida un proceso tradicionalmente lento y laborioso y lo reduce a 10 minutos.

Especificidad de la norma Gold: resultados superiores con los reactivos MicroRNA TaqMan™

Applied Biosystems ha desarrollado una solución de vanguardia al problema fundamental asociado con la corta duración de miARN maduros. Los ensayos de MicroRNA TaqMan™ (se venden por separado) incluyen un cebador de transcripción inversa de bucle de tallo específico para el objetivo (figura 2). La estructura en bucle-tallo está diseñada para incorporar especificidad para el miARN maduro dirigido, en contraste con otros métodos que extienden y ceban indiscriminadamente todo el ARN en una muestra. Los reactivos de MicroRNA RT TaqMan™, incluidos en el kit Cells-to-C_T™ MicroRNA de TaqMan™, se han diseñado específicamente para funcionar junto con este innovador diseño de ensayo.

La capacidad de distinguir entre objetivos de miARN maduros altamente homólogos es necesaria para un análisis preciso de la expresión del miARN. El kit Cells-to-C_T™ microARN TaqMan™, junto con los ensayos de microARN TaqMan™, proporciona la especificidad necesaria para distinguir entre objetivos altamente homólogos, como se observa en la figura 3. En este ejemplo, se utilizaron lisados del kit Cells-to-C_T™ MicroRNA de TaqMan™ o miARN purificado en PCR en tiempo real utilizando ensayos de MicroRNA de TaqMan™ para detectar diferencias de base única en moldes de miARN añadidas exógenamente. La especificidad obtenida con los lisados del kit Cell-to-C_T™ microARN TaqMan™ (figura 3A) fue equivalente a la del ARN purificado (figura 3B).

Rendimiento sólido: resultados equivalentes al ARN purificado

Este nuevo kit se ha probado exhaustivamente con una amplia selección de ensayos de microARN TaqMan™ y ha demostrado un rendimiento equivalente al obtenido con ARN purificado (Figura 4). El kit Cell-to-C_T™ microARN TaqMan™ permite una evaluación de la expresión de miARN sin igual con >900 ensayos de microARN TaqMan™ disponibles.

Rango dinámico de entrada amplia: detección lineal de 10 a 100 000 células

Debido a que los niveles de expresión de miARN pueden variar ampliamente por el tipo de muestra, la etapa de desarrollo o la progresión de la enfermedad, es importante contar con herramientas sensibles para el análisis de expresión de miARN. Ahora, los objetivos de miARN que varían de unas pocas copias a millones de copias se pueden cuantificar con precisión en el mismo experimento.

El kit Cell-to-C_T™ microARN TaqMan™ funciona con tan solo 10 células y con hasta 100 000 células. Además, para maximizar la sensibilidad, el kit Cell-to-C_T™ microARN TaqMan™ permite que hasta el 33 % del volumen de reacción de RT se componga de lisado de muestras (RT singleplex). La figura 5 muestra la linealidad y sensibilidad de la detección de los lisados del kit Cell-to-C_T™ microARN TaqMan™ a través de 5 registros de entrada celular por reacción de lisis; los resultados fueron equivalentes al ARN purificado. Además, la amplia gama dinámica de ensayos de microARN TaqMan™ no se ve comprometida por los lisados del kit Cell-to-C_T™ microARN TaqMan™ (no se muestran los datos).

Rendimiento probado conjuntamente

Todos los componentes del kit Cell-to-C_T™ microARN TaqMan™ se han optimizado para obtener un rendimiento uniforme y fiable. Esto elimina las conjeturas que conllevan el montaje de kits independientes para la preparación de muestras, la transcripción inversa y la PCR en tiempo real. El kit Cell-to-C_T™ microARN TaqMan™ se ha validado con ensayos de microARN TaqMan™ para ofrecer una mayor garantía de calidad.