El kit Ambion™ Single Cell-to-C_T™ contiene un flujo de trabajo validado completo para el análisis de expresión génica para muestras que contienen 1–10 células. Cada kit contiene reactivos para la preparación de muestras, la transcripción inversa, la preamplificación y la qPCR que se han optimizado conjuntamente en un flujo de trabajo sencillo que se puede completar en solo cinco pasos (consulte la figura).

Características clave del producto:

• Flujo de trabajo preoptimizado para RT-PCR en tiempo real a partir de células individuales
• Sensibilidad máxima para el análisis de células individuales
• Rendimiento y reproducibilidad superiores en comparación con métodos alternativos
• Kit completo práctico y protocolo fácil de seguir

El protocolo preoptimizado garantiza el éxito y ahorra tiempo
Cada flujo de trabajo comienza con una sencilla preparación de muestras de siete minutos, en la que las células se lisan de forma eficaz y reproducible con un procesamiento mínimo en una solución compatible con RT-PCR posterior, sin necesidad de purificación. A esto le sigue el uso de Superscript RT™ para la transcripción inversa, la mezcla maestra TaqMan Preamp™ para amplificar el ADNc, y la mezcla maestra TaqMan™ Gene Expression para qPCR. Estos cuatro pasos se han desarrollado para proporcionar la máxima sensibilidad. Toda la muestra celular se mantiene en el mismo pocillo durante todo el procedimiento, por lo que no hay pérdida de muestra ni dilución del preciado material limitado, lo que podría afectar a la sensibilidad.

Sensibilidad de células individuales
La sensibilidad de los resultados de PCR en tiempo real puede verse afectada por la eficacia de la preparación de muestras, la transcripción inversa o la amplificación. El kit Single Cell-to-C_T™ ha abordado cada una de estas áreas problemáticas potenciales para crear una solución que permita un análisis fiable y robusto de la expresión génica a partir de células únicas con máxima sensibilidad. La detección de equivalentes monocelulares mediante el kit Single Cell-to-C_T™ demuestra la linealidad y sensibilidad adecuadas de los resultados de qPCR en comparación con un control de muestras de 100 células con una excelente reproducibilidad técnica (véase la figura). Tal como se esperaba, las células individuales presentan una mayor variabilidad debido a la heterogeneidad biológica inherente. Además, mediante la inclusión de un paso de preamplificación de ADNc, los objetivos de interés se amplifican con precisión antes de la PCR en tiempo real. Este paso crítico aumenta la señal de manera imparcial, ampliando el potencial de análisis de muestras limitadas. Se muestra la precisión y la mejora de la señal de un panel de 96 genes mediante preamplificación (consulte la figura).

Rendimiento y reproducibilidad superiores en comparación con los métodos alternativos
Los métodos tradicionales de preparación de muestras que utilizan disolventes orgánicos, filtros de fibra de vidrio o gránulos magnéticos no son adecuados para el análisis de una sola célula debido a la pérdida de la muestra a través de la precipitación incompleta del ARN, la unión y la elución. Además, la mayoría de los métodos caseros monocelulares que implican la simple ebullición para lisar células carecen de la capacidad de inactivar las RNasas endógenas para estabilizar los perfiles de expresión génica y pueden dar lugar a la división química del ARN y el arrastre de inhibidores, incluida la contaminación por ADNg, lo que puede afectar a todas las aplicaciones de qRT-PCR. Por el contrario, el kit Single Cell-to-C_T™ muestra una sensibilidad y reproducibilidad superiores para el análisis de células individuales en comparación con los métodos tradicionales de purificación o los métodos de hervido casero (véase la figura).