HotStart-IT Binding Protein

Aplicación
Amplificación de PCR de inicio en caliente

La proteína de unión HotStart-IT™ es el componente activo de una novedosa tecnología de arranque en caliente llamada captura de cebadores. En general, los métodos de PCR de inicio en caliente reducen o eliminan los productos de extensión de cebadores no específicos formados a temperaturas más bajas durante el montaje de reacciones de PCR. A estas temperaturas de hibridación del cebador menos estrictas, los cebadores pueden unirse de manera no específica, lo que a menudo da lugar a productos de amplificación no deseados y a dímeros de cebadores. Con el fin de resolver este problema, hemos producido una proteína de unión de ADN de alta calidad que es especialmente útil en la captura de cebadoes a temperaturas más bajas, lo que hace que no estén disponibles para su uso por una polimerasa (Fig. 1). Esta técnica de captura de cebador bloquea eficazmente la síntesis de ADN de eventos de cebado incorrecto a temperaturas más bajas. Tras el paso inicial de desnaturalización durante la PCR, la proteína se inactiva y los cebadores pueden participar en la reacción de amplificación. A diferencia de otros métodos de arranque en caliente, como anticuerpos o modificaciones químicas, la proteína de unión es compatible con una variedad de polimerasas termoestables. La proteína de unión HotStart-IT se ha diseñado para aplicaciones de PCR que exigen una especificidad y sensibilidad extremadamente altas y se ha probado exhaustivamente para obtener pureza y rendimiento.

Propiedades
La proteína de unión HotStart-IT funciona bien en muchos tampones de reacción PCR estándar.

Pureza
Libre de nucleasas no específicas detectables.

Tampón de almacenamiento
20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 200 mM de KCl, 0,1 mM de EDTA, 1 mm de DTT y 50 % de glicerol.

Definición de masa
En general, un microgramo de HotStart-IT de proteínas de unión HotStart-IT capta alrededor de 5 pmol de cebadores.

Concentración
10 ±0,5 mg/ml

Fuente
Proteína recombinanda expresada en E. coli.

Ventajas de HotStart-IT
• Configuración de la reacción a temperatura ambiente
• Alta especificidad y sensibilidad
• Minimiza la amplificación de productos no específicos y de los dímeros de cebadores (Fig. 2)
• Ideal para plantillas complejas y reacciones múltiples
• A diferencia de la Taq modificada químicamente, no es necesario un paso de calentamiento extenso que pueda dañar las muestras valiosas
• La tecnología puede trasladarse a una polimerasa de su elección.

Control de calidad del ensayo bloqueante de la polimerasa
Este ensayo compara la cantidad de actividad de la ADN polimerasa Taq con 2 µg de proteína de unión HotStart-IT frente a su actividad sin proteína de unión. Las mezclas de reacción contienen 0,625 unidades de polimerasa, 1 tampón de reacción de PCR (10 mM Tris-HCl [pH 8,6], 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl₂), 0,2 mM de cada dNTP, y 2 pmol de oligonucleótidos superpuestos y extensibles en un volumen de reacción de 25 µl. Tras la incubación a 25 °C durante 4 horas, la proteína de unión HotStart-IT bloquea al menos el 90 % de la actividad de la ADN polimerasa Taq. (Consulte la Fig. 2 para datos representativos.)

Prueba funcional
La PCR con ADN polimerasa Taq y proteína de unión HotStart-IT traslada la producción de dímeros de cebadores a un objetivo específico de 306 bp de 1 ng de ADN genómico humano en relación con ADN polimerasa Taq solo.