Poly(A) Polymerase, Yeast

La polimerasa de poli(A) cataliza la adición de residuos de adenosina en los extremos 3' del ARN. Se puede utilizar para agregar colas poli(A) al ARN en el primer paso de la clonación. La reacción requiere Mn²⁺ o mg²⁺, ATP como sustrato, y cualquier ARN que contenga hidroxilo del extremo 3’ como cebador. La sustitución de la cordicepina-5'-trifosfato (3'-dATP) por ATP da como resultado la adición de un solo residuo 3'-dA en los extremos del ARN, una técnica útil para marcar el ARN en el extremo 3'.

En estudios comparativos, la polimerasa poli(A) de levadura funciona de manera más eficiente que la polimerasa poli(A) E. coli para el etiquetado de oligonucleótidos del ARN y la adición de poli(A). La enzima de la levadura requiere tiempos de incubación más cortos y se obtiene que etiqueta tanto sustratos largos y cortos igual de bien. La polimerasa poli(A) se recomienda sobre la T4 RNA Ligase para el etiquetado de extremo 3' de moléculas de RNA largas.

*Nota: También se pueden utilizar varios nucleótidos modificados para etiquetar el extremo 3' del ARN usando polimerasa poli(A) de levadura.

Pureza:
Sin ribonucleasa

Tampón de almacenamiento:
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM KCl, 0,5 mM DTT, 50 % glicerol.

Condiciones del ensayo:
2 5 mM de Tris-HCl (pH 7,0), 40 mM de KCl, 0,5 mM de MnCl₂, 0,05 mM de EDTA, 0,5 mM de DTT, 0,2 mg/ml de BSA, 10 % de glicerol, 3,3 µM de ATP radiomarcado, 0,5 mm de ATP, 6,5 µg de poli(A) (∼100 bases), polimerasa poli(A). Después de la incubación a 37 °C durante 10 min, se determina la radioactividad insoluble en ácido.

Definición de unidad:
Una unidad equivale a 15 pmol/min AMP incorporado en (riboA)15 a 37 °C.

Concentración:
600 unidades/µl

Ensayo funcional:
Etiqueta de extremo 3' de un ribonucleótido con cordicepina-5'-trifosfato.

Tampón de reacción de poli(A) 5X probado funcionalmente (1 ml incluido, PN 74226):
100 mM Tris-HCl, pH 7,0, 3,0 mM MnCl₂, 0,1 mm EDTA, 1 mm DTT, 500 µg/ml BSA acetilada, 50 % glicerol.

Aplicaciones:
  1.Adición de colas poli(A) al ARN.
  2.Etiquetado de los extremos 3' del ARN.

Fuente:
Cepa de E. coli que contiene un clon sobreproductor de poli(A) polimerasa de levadura.