Bac-to-Bac™ C-His TOPO™ Expression System
Bac-to-Bac™ C-His TOPO™ Expression System
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Bac-to-Bac™ C-His TOPO™ Expression System

La expresión de baculovirus Bac-to-Bac es un método eficaz para producir baculovirus para la expresión de proteínas de alto nivelMás información
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La expresión de baculovirus Bac-to-Bac es un método eficaz para producir baculovirus para la expresión de proteínas de alto nivel en células de insectos. Se basa en la generación de virus recombinante por la transposición específica del sitio en E. coli en lugar de una recombinación homóloga en células de insectos. El sistema de expresión pFastBac C-His TOPO incluye:

Flexibilidad: el vector Bac-to-Bac C-HIS TOPO contiene una etiqueta His con terminación de tipo C con un sitio de escisión TEV para facilitar la purificación de proteínas marcadas con His con resinas quelantes de níquel (como el sistema de purificación Invitrogen ProBond) y la generación de proteínas nativas con la ayuda de la proteasa Invitrogen AcTEV.

Clonación rápida y fácil detección: la tecnología de clonación Blunt TOPO permite la clonación de productos de PCR de extremo romo en el vector pFastBac TOPO en cinco minutos. Además, el kit de expresión pFastBac TOPO se suministra con E. coli Mach1-T1R que permite la visualización de colonias ocho horas después de la exposición en placas selectivas de ampicilina debido a su tiempo de duplicación más rápido en comparación con otras cepas de clonación estándar. Obtenga más información sobre las ventajas de la clonación TOPO ›

Alta eficacia de transfección con el reactivo de transfección ExpiFectamine SF: los kits de expresión TOPO Bac-to-Bac ahora incluyen la última generación de reactivos de transfección ExpiFectamine SF para una transfección de ADN eficaz en células de insectos utilizando protocolos rápidos y flexibles. Obtenga más información sobre este reactivo ›

Bacmid de expresión que ahorra tiempo: con el sistema Bac-to-Bac, el casete de expresión del vector pFastBac se recombina con el bacmid padre en las células competentes de E. coli DH10Bac para formar un bacilo de expresión. A continuación, el bacmid se transfecta en células de insectos para producir partículas recombinantes de baculovirus.

Fácil detección de colonias: el bacmid en la E. coli DH10Bac contiene un segmento del gen lacZa. El gen lacZa se interrumpe tras la transposición del casete de expresión en el bacilo, lo que permite la selección azul/blanca de recombinantes para facilitar la identificación de colonias recombinantes.

Alta expresión de proteínas: el vector pFastBac utiliza el potente promotor de poliedrina para generar altos niveles de expresión en una variedad de líneas celulares de insectos como Sf9, Sf21 y células High Five.

Para uso exclusivo en investigación. No apto para uso en procedimientos diagnósticos.
Especificaciones
Resistencia bacteriana a los antibióticosAmpicilina (AMPR), gentamicina (GMR)
Método de clonaciónBlunt TOPO™
Mecanismo de expresiónExpresión basada en células
FormatoLíquido
Línea de productosBAC-to-Bac, TOPO
Etiqueta de proteínaEtiqueta His (6x)
Cantidad20 reacciones
Sistema de expresiónBaculovirus
PromotorPoliedrina
TipoSistema de expresión
Unit SizeEach
Contenido y almacenamiento
Kit de expresión BAC-to-Bac C-His TOPO:
• Kit de vectores para 20 reacciones de clonación TOPO, almacenar a -20 °C
   –Vector pFastBac/CT-TOPO que contiene el sitio de segmentación TEV de la terminación de tipo C y la etiqueta His
   –Plásmido de control pFastBac 1-Gus con etiqueta His (vector de expresión de control)
   –Otros reactivos del kit: 10x PCR, mezcla de dNTP, solución salina, agua estéril, plantilla de PCR de control, primer delantera de poliedrina, primer inversa SV40 PA
E. coli One Shot Mach1-T1R químicamente competente para 20 reacciones (20 x 50 µl), almacenar a -80 °C
E. coli Competente MAX Efficiency DH10Bac para 20 reacciones (cuatro kits con 5 x 0,1 ml cada uno), almacenar a -80 °C
• reactivo de transfección ExpiFectamine SF (1 ml), almacenar a 4 °C, no congelar

Preguntas frecuentes

I cannot detect any recombinant fusion protein after using the BaculoDirect Expression Kit. What could be the cause for this and what do you suggest I try?

Please check the construction of your entry clone, and ensure that the insert is in frame with the vector. Analyze the recombinant viral DNA by PCR to confirm the correct size and orientation of your insert after the LR reaction. Sequence your PCR product to verify the proper reading frame for expression of the epitope tag.

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I'm getting a low-titer P1 viral stock and would like to generate a high-titer stock. What should I do?

To get a high-titer stock, reinfect cells with the P1 stock and generate a P2 high-titer stock. Follow the directions in the BaculoDirect manual on page 18 to generate your P2 stock.

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I performed an LR reaction, followed by transfection into Sf9/Sf21 insect cells, but do not see any signs of infection even though it's been 72 hours. What should i do?

Please see our recommendations below:

- Check the LR reaction by PCR analysis prior to transfection into insect cells.
- We recommend using Grace's Insect Cell Culture Medium, Unsupplemented during the transfection experiment instead of serum-free medium, as components in serum-free medium may interfere with transfection.
- Ensure that FBS, supplements, or antibiotics are not included during transfection, as the proteins in these materials can interfere with the Cellfectin II Reagent.
- Use the LR recombination reaction using the pENTR/CAT plasmid as a positive control and Cellfectin II Reagent only (mock transfection) as a negative control.
- Ensure that cells are in the log phase of growth with >95% viability, and the amount of cells are in accordance with the suggestions in the manual.
- Cells may not show signs of viral infection for up to a week depending on transfection efficiency; continue culturing and monitor cells daily for signs of infection.

I see a precipitate in my ganciclovir solution. What can I do?

Warm the ganciclovir solution in a water bath at 37 degrees C for 5-10 min, then vortex for a few minutes. The precipitate should go back into solution.

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I am purifying my secreted protein expressed in insect cells with a His-tagged purification column and getting no yield of my protein. Why and what can I do?

Media used to culture insect cells usually have an acidic pH (6.0-6.5) or contain electron-donating groups that can prevent binding of the 6xHis-tagged protein to Ni-NTA. Amino acids such as glutamine, glycine, or histidine are present at significantly higher concentrations in media for growing insect cells than in media for growing mammalian cells, and compete with the 6xHis-tagged protein for binding sites on Ni-NTA matrices. Grace's medium (Thermo Fisher Scientific), for example, contains approximately 10 mM glutamine, 10 mM glycine, and 15 mM histidine.

Dialysis of the medium against a buffer with the appropriate composition and pH (8.0) similar to the lysis buffer recommended for purification under native conditions usually restores optimal binding conditions. Note that depending on the medium used, a white precipitate (probably made up of insoluble salts) can occur, but normally the 6xHis-tagged protein remains in solution. This can be tested by either protein quantitation if using a protein-free medium or by monitoring the amount of 6xHis-tagged protein by western-blot analysis. After centrifugation, 6xHis-tagged protein can be directly purified from the cleared supernatant.

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