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Kit de vectores ViraPower™ HiPerform™ Promoterless Gateway™

El kit de vectores ViraPower HiPerform Promoterless Gateway contiene el vector de expresión lentiviral sin promotor ViraPower HiPerform adaptado a Multi-Site Gateway, pLenti6.4⁄R4R2⁄V5-DEST para una clonación basada en recombinación sencilla y de un gen diana en células de mamíferos que se dividen y no se dividen.

Número de catálogo	Cantidad
A11146	20 reacciones

Número de catálogo A11146

Precio (MXN)

Cantidad:

20 reacciones

The ViraPower™ HiPerform™ Promoterless Gateway™ Vector Kit contains the MultiSite Gateway™-adapted ViraPower™ HiPerform™ promoterless lentiviral expression vector, pLenti6.4/R4R2/V5-DEST™ for easy recombination-based cloning and lentiviral-based high-level expression of a target gene from any promoter of choice in dividing and non-dividing mammalian cells. The pLenti6.4/R4R2/V5-DEST™ vector is equipped with two key genetic elements, making it a HiPerform™ vector: the Woodchuck Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE) and the central Polypurine Tract (cPPT) sequence from the HIV-1 integrase gene to produce at least 4-fold increase in protein expression compared to vectors lacking these elements.

El kit de vector The ViraPower™ HiPerform™ Promoterless Gateway™ contiene el vector de expresión lentiviral sin promotor MultiSite Gateway™ adaptado ViraPower™ HiPerform™, pLenti6.4⁄R4R2⁄V5-DEST™ para una clonación fácil basada en recombinación y expresión de alto nivel de un gen diana en células de mamíferos que se dividen y no se dividen. El vector pLenti6.4 ⁄R4R2⁄V5-DEST™ está equipado con dos elementos genéticos clave, lo que lo convierte en un vector HiPerform™: el elemento regulador postranscripcional Woodchuck (WPRE) y la secuencia del tracto central de polipurinas (cPPT) del gen de la integrasa VIH-1 para producir al menos 4 veces más en la expresión de proteínas que los vectores que carecen de estos elementos.

Ventajas
• Genera lentivirus incompetente para la replicación para la transducción de células de mamíferos que se dividen y no se dividen
• Clonación fácil, simultánea y basada en la recombinación de múltiples fragmentos de ADN en un orden y orientación definidos mediante tecnología MultiSite Gateway™
• Expresión del gen diana bajo el control de un promotor de elección
• Expresión estable a largo plazo
• Expresión de proteínas mejorada, hasta 4 veces o más, en comparación con los sistemas tradicionales de expresión lentiviral

Características principales
• WPRE del virus de la hepatitis woodchuck, permite una mayor expresión transgénica y el cPPT del gen de la integrasa VIH-1, aumenta el número de copias del lentivirus que se integra en el genoma del huésped, aumentando así el título viral. Juntos, el WPRE y cPPT hacen que la expresión de proteínas en la mayoría de los tipos de células sea cuatro veces mayor en comparación con otros vectores que no contienen estos elementos.
• Vector sin promotor para expresar el gen diana bajo el control de un promotor de elección
• Marcador de selección de blasticidina para la selección estable bajo el control del promotor PGK para la expresión a largo plazo y persistente

El kit incluye
• pLenti6.4⁄R4R2⁄V5-DEST™ Kit
• pENTR™ 5’ TOPO™ Kit de TA Cloning (n.º de cat. K59120)
• One Shot™ Stbl3™ E. coli químicamente competente (n.º de cat. C737303)
• pENTR™ Gus plásmido de control positivo.

Solo para uso en investigación. No diseñado para uso diagnóstico o terapéutico.

Para uso exclusivo en investigación. No apto para uso en procedimientos diagnósticos.

Especificaciones

Resistencia bacteriana a los antibióticosAmpicilina (AmpR), blasticidina (BsdR)

HendiduraNo hay sitio de escisión

Sistema constitutivo o inducibleConstitutivo

Tipo de entregaLentivírico

Para utilizar con (aplicación)Clone su propio promotor, expresión vírica

Enzima de la pasarelaLR Clonase™ II Plus, LR Clonase™ II

Enzima de PCRPolimerasa de corrección

Tipo de productoKit de vectores

Posición de la etiqueta de la proteína (a su gen)C-terminal

Cantidad20 reacciones

Origen de replicaciónOrigen de pUC

Agente de selección (eucariótico)Blasticidina

Marcador de selección eucariotaBsdR

Promotor del marcador de selecciónPromotor de PGK

Elementos especialesWPRE, cPPT

VectorpLenti

Método de clonaciónGateway

Línea de productosGateway, HiPerform, ViraPower

PromotorNinguno (sin promotor), EF-1α, CMV

Etiqueta de proteínaEtiqueta de epítopo V5

Unit SizeEach

Contenido y almacenamiento

Contenido
El kit de vector ViraPower™ HiPerform™ sin promotor Gateway™ incluye los siguientes componentes:

• pLenti6.4⁄R4R2⁄V5-DEST™ Kit que incluye:

6 µg de pLenti6.4⁄R4R2⁄V5-DEST™ vector (40 µL of vector a 150 ng⁄µL en tampón TE, pH 8,0)

10 µg de pLenti6.4⁄CMV⁄V5-MSGW⁄lacZ plasmídico (20 µL de vector a 0,5 µg⁄µL en tampón TE, pH 8,0)

10 µg de pENTR 5’⁄CMVp plasmídico (20 µL de plasmídico a 0,5 µg⁄µL en tampón TE, pH 8,0)

10 µg de pENTR 5’⁄EF1αp plasmídico (20 µL de plasmídico a 0,5 µg⁄µL en tampón TE, pH 8,0)

• pENTR 5’ Kit TA Cloning TOPO™ (n.º de cat. K95120) que incluye:

Reactivos pENTR 5’ TOPO™

One Shot™ TOP10 E.coli químicamente competente (n.º de cat. C404003)

E. coli químicamente competente One Shot™ Stbl3™ (n.º de cat. C737303): 21 x 50 µl de células Stbl3™, 6 ml de SOC Medio y 50 µl de ADN de control pUC19 (10 pg⁄µl)

Plásmido de control GUS positivo pENTR™

Almacenamiento
• Kit pLenti6.4⁄R4R2⁄V5-DEST™: -20 °C
• Reactivos pENTR™ 5’ TOPO™: -20° ºC
• One Shot™ Stbl3™ E.coli químicamente competente: -80 °C
• E. coli químicamente competente One Shot™ TOP10: -80° ºC
• pENTR™ control positivo GUS: -20 °C

Preguntas frecuentes

Do 293FT cells lift off the plate during lentivirus production?

If 293FT cells detach shortly after transfection (4 hours to overnight):

- This may be a sign of Lipofectamine 2000 toxicity. Cells may have been plated too sparsely prior to transfection.
- The cells may not have been handled gently enough (these cells have a tendency to lift off easily).
- The cells may have been kept at room temperature for too long.

If cells detach 48 to 72 hours post-transfection:
- If the cells lift off in large sheets, this may be a sign of lentivirus production.

What are syncytia?

Syncytia are large multi-nucleated cells that result from VSV-G-induced fusion with neighboring 293FT producer cells. Syncytia production is indicative of high transfection efficiency and lentivirus production. Keep in mind, though, that the absence of syncytia does not mean that virus will not be produced.

Find additional tips, troubleshooting help, and resources within our Protein Expression Support Center.

Why do I have to culture 293FT cells under Geneticin antibiotic selection?

The 293FT cell line stably expresses the SV40 large T antigen from the pCMVSPORT6Tag.neo plasmid that contains the neomycin resistance marker. In order to maintain the plasmid/phenotype, the cells have to be routinely cultured in medium containing Geneticin (G418) antibiotic at a concentration of 500 µg/mL.

Do you recommend a specific FBS for culturing 293FT cells? Which plastic plates do you recommend?

We use Mycoplasma-tested Gibco FBS (Cat. No. 16000-044). We have observed that when 293FT cells are cultured in the presence of this FBS following the instructions in the manual, virus production is better than that obtained with many other serum sources. We use the following plasticware for 293FT cells:

T175-Fisher Cat. No. 10-126-13; this is a Falcon flask with 0.2 µm vented plug seal cap.
T75-Fisher Cat. No. 07-200-68; this is a Costar flask with 0.2 µm vented seal cap.
100 mm plate-Fisher Cat. No. 08-772E; this is a Falcon tissue culture-treated polystyrene plate.
We get excellent adherence on these plates under routine cell culture/maintenance conditions.

Do you offer a promoterless lentiviral vector where I can introduce my own promoter?

We offer the ViraPower HiPerform Promoterless Gateway Expression System (Cat. No. A11145) that combines ViraPower HiPerform Lentiviral and MultiSite Gateway technologies to facilitate easy recombination-based cloning and lentiviral-based high-level expression of a target gene from any promoter of choice in dividing and non-dividing mammalian cells. The ViraPower HiPerform Promoterless GatewayVector Kit is available separately (Cat. No. A11146).

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