Bac-to-Bac™ HBM TOPO™ Cloning Kit

La expresión de baculovirus Bac-to-Bac™ es un método eficaz para producir baculovirus para la expresión de proteínas de alto nivelMás información

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A11338

Número de catálogo A11338

Precio (MXN)

La expresión de baculovirus Bac-to-Bac™ es un método eficaz para producir baculovirus para la expresión de proteínas de alto nivel en células de insectos. Se basa en la generación de virus recombinante por la transposición específica de sitio en E. coli (DH10Bac™) en lugar de una recombinación homóloga en células de insectos. El nuevo vector pFastBac™ HBM TOPO™ permite la expresión secretada de proteínas porque tiene la señal de secreción de melitina de abeja (HBM). Se debería considerar el nuevo vector para la expresión de las glicoproteínas. Las glicoproteínas no pueden ser glicosiladas en ausencia de cualquier señal de secreción. En contraste con las glicoproteínas secretadas de células de mamíferos, las glicoproteínas secretadas de baculovirus se pueden desglicosilar fácilmente in vitro. Esta es una característica muy importante para cristalizar las proteínas!

El vector pFastBac™ HBM TOPO™ también tiene una etiqueta His con terminación de tipo C con una señal de segmentación TEV que permite una fácil purificación de las proteínas de fusión de histidina en resinas quelantes de níquel (sistema de purificación ProBond™) y proteínas nativas con la ayuda de la proteasa AcTev™.
El vector utiliza el fuerte promotor de poliedrina para generar altos niveles de expresión en una variedad de líneas celulares de insectos como Sf9, Mimic™ Sf9, Sf21, y células High Five™ en medios SF-900 II & SF-900™ III de Gibco.

Los sistemas tradicionales de baculovirus requieren la purificación y amplificación de un sobrenadante viral inicial de bajo título. Esto necesita un análisis de placa, que requiere mucho tiempo. Sin embargo, los vectores Bac-to-Bac™ pFastBac™ se recombinan con el bácmido en células competentes de E. coli DH10Bac™ para formar un bacilo de expresión. Transfecta el bacmid en células de insectos para la producción rápida de un alto título de partículas de baculovirus recombinantes puros en la primera transfección. Ahorrará varias semanas de su valioso tiempo. Recoja un suministro de baculovirus P2 puro el día 10 sin necesidad de un tedioso ensayo de placas.

Para uso exclusivo en investigación. No apto para uso en procedimientos diagnósticos.

Especificaciones

Línea de célulasHigh Five™, Sf21, Sf9

Tipo de célulaCélula de insecto

HendiduraLugar de reconocimiento de proteasas TEV

Método de clonaciónBlunt TOPO

Mecanismo de expresiónExpresión basada en células

Sistema de expresiónBaculovirus

Para utilizar con (aplicación)Expresión de proteínas

Compatibilidad de alto rendimientoCompatible con alto rendimiento, no compatible con alto rendimiento (manual)

de control principalExpresión secretada

N.º de reacciones20 reacciones

Línea de productosBac-to-Bac, TOPO

Tipo de productoKit de clonación

PromotorPoliedrina

Etiqueta de proteínaHBM (melitina de abeja), etiqueta His (6x)

Agente de selección (eucariótico)Ninguno

VectorpFastBac/HBM-TOPO

FormatoKit

Unit SizeEach

Contenido y almacenamiento

Kit de clonación Bac-to-Bac™ HBM TOPO™ contiene: (Para obtener más información, consulte el manual)
• Kit de vectores para 20 reacciones de clonación TOPO
• Vector pFastBac⁄HBM TOPO™ que contiene el sitio de segmentación TEV de la terminación de tipo C y la etiqueta His.
• Plásmido de control PFastBac⁄CT-Gus (vector de expresión de control)
• Otros reactivos suministrados: 10x PCR, mezcla de dNTP, solución salina, agua estéril, plantilla de PCR de control, cebador de avance de polihedrina,
• kit de cebador inverso SV40 pA que contiene células competentes (20 reacciones):
• E. coli One Shot™ Mach1-T1R químicamente competente

Kit de vectores: almacenar a -20 °C
E. coli One Shot™ Mach1-T1R químicamente competente: almacenar a -80 °C

Preguntas frecuentes

I cannot grow this white colony in liquid culture. What should I do?

The concentration of gentamicin might be too high. Try lowering the amount to 5 µg/mL and try adding more of the colony to the culture medium.

What has happened when I see blue colonies? How about colonies which are blue in the center and white on the edges?

In the case of a blue colony, the E. coli has the bacmid and the plasmid in it, allowing the cells to survive the selection process. However, because the transposition has not occurred, the LacZ gene is not disrupted. For bulls-eye colonies, this indicates that the transposition took place when the colony was growing. Re-streaking for an isolated clone from the white portion of the mixed colony should yield some colonies where transposition occurred.

I'm getting mostly white/wild-type plaques instead of blue/recombinant plaques. What am I doing wrong?

This is typically an indication of poor homologous recombination. Check the plasmid/linear DNA ratio you used. If there are some blue plaques, however, expand those viruses and check for their protein. In our experience, they are correct, even if they were in relatively low abundance.

I've infected my cells and see large polyhedra in one cell and smaller polyhedra (more numerous) in a neighboring cell. Is this normal?

Yes, cells are infected with wild-type virus individually and will develop polyhedra at different rates until all the cells in the flask are infected. The polyhedra in cells will form in approximately 3-4 days, differing in size and number until they reach their maximum capacity and burst the cell, releasing tiny particles of virus into the medium.

I'm worried that I am not getting plaques. How many days does it take to see plaques and what size are they typically?

Normally, very small white dots show up about 5-7 days and 1 mm plaques show up around day 10. Plaques can vary in size from 1 mm to 4 mm.

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