GeneArt™ Chlamydomonas Protein Expression Vector

El vector de expresión de proteínas del Chlamydomonas GeneArt™ es nuestro vector de expresión de proteínas del Chlamydomonas de segunda generación para la expresión transgénica del genoma nuclear del alga verde eucariota Chlamydomonas reinhardtii 137c. Está optimizado para la expresión relativa de alto nivel, proporciona selección contra el silenciamiento de genes y ofrece etiquetas duales de proteínas para la detección y/o purificación de su gen de interés. El kit incluye vector de expresión y protocolos fáciles de seguir. Nuestro medio GIBCO™ TAP, ofrecido por separado, está optimizado para el crecimiento y mantenimiento de Chlamydomonas. La Chlamydomonas reinhardtii 137c está disponible en Chlamydomonas Resource Center.

• Expresar hasta un 1 % de proteína soluble total de su gen de interés
• Seleccionar contra el silenciamiento de genes incluso en múltiples pasajes
• Detectar y purificar su gen de interés con etiquetas de epítopo 6His-TEV y/o V5-His
• Compatible con el montaje sin fisuras para la creación de sus construcciones
• Le permite recibir resultados fiables con excepcional viabilidad y pureza de la cepa

Vector Chlamydomonas pChlamy_4
La expresión transgénica del genoma nuclear de Chlamydomonas ofrece varias ventajas sobre la expresión del cloroplasto, tales como modificaciones postranslacionales y selección de proteínas y/o secreción. Sin embargo, la expresión del genoma nuclear ha sido típicamente menos que robusta, y no se comprenden completamente los mecanismos moleculares de expresión deficiente. Entre las posibles razones se encuentran los promotores deficientes, los efectos de la posición de integración del genoma y el silenciamiento transgénico. El vector de expresión de proteínas del Chlamydomonas GeneArt proporciona niveles altos relativos de proteína expresada y selección contra el silenciamiento. Nuestro vector pChlamy_4 también es compatible con la clonación sin costuras, un método de clonación opcional que no produce secuencias adicionales en su construcción final.

Las características del vector incluyen:
• El promotor endógeno y constitutivo, Hsp70A-RbcS2, está compuesto por el activador Hsp70A y dos copias de la secuencia de intrones RBC S2, lo que ofrece una mayor expresión de su gen de interés
• El promotor híbrido Hsp70A-RBC S2 fusionado con el gen de resistencia a la bleomicina/Zeocin™ permite que los transformantes positivos mantengan los niveles de expresión de proteínas para múltiples pasajes
• La secuencia de autoescisión para el péptido 2A del virus de la enfermedad de la fiebre aftosa (FMDV) media una escisión adecuada entre los marcadores de resistencia y la proteína de interés para producir dos proteínas discretas
• 3’ UTR para la correcta terminación de la transcripción y posibles beneficios adicionales como el aumento de la eficacia de la traducción, la estabilidad del ARNm y señales de poliadenilación
• Las etiquetas duales de proteínas de epítopos 6His-TEV y V5-His pueden fusionarse a ambos o a cualquiera de los extremos de su gen de interés, o no haber ninguna etiqueta en absoluto

Selección contra el silenciamiento
Con el fin de evitar el silenciamiento transgénico que a menudo ocurre en C. reinhardtii, nuestro nuevo vector pChlamy_4 está diseñado para que las proteínas se expresen como fusiones transcripcionales con el gen sh-ble de resistencia a la bleomicina/Zeocin. La secuencia de autoescisión para el péptido 2A del virus de la fiebre aftosa (FMDV) se coloca entre el gen de resistencia a los antibióticos y el gen de interés. Codifica una secuencia corta de ∼ 20 aminoácidos que media una escisión adecuada para producir dos proteínas discretas. Con este sistema hemos visto transformantes positivos mantener altos niveles de expresión durante mucho más tiempo que con otros sistemas, incluso después de muchos pasajes con o sin presión de selección.

Reactivo de transformación de máxima eficiencia para algas
Uno de los mayores obstáculos en la investigación y el desarrollo con Chlamydomonas ha sido la introducción de ADN exógeno en las cepas de Chlamydomonas debido a paredes celulares rígidas.