LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System

El LeukoLOCK™ es un método innovador para el fraccionamiento celular de sangre completa y estabilización y extracción de ARN total de la población de leucocitos. El kit está compuesto por un kit de fraccionamiento y estabilización LeukoLOCK™ (también disponible por separado; n.° de cat. AM1933) y un kit de aislamiento de ARN total LeukoLOCK™.

• Fracciona los leucocitos de sangre completa en minutos
• Extrae el ARN total de los leucocitos
• No se requieren pasos adicionales de reducción de la globina
• Estabiliza el ARN para preservar el perfil de expresión
• Conserva los leucocitos a temperatura ambiente durante días

El sistema LeukoLOCK™ está optimizado para su uso con sangre humana. La sangre es un almacén de información celular, pero la presencia de ARNm de globina en el ARN preparado a partir de sangre completa puede interferir con las aplicaciones posteriores de análisis de expresión. El sistema LeukoLOCK™ emplea tecnología de eliminación de leucocitos basada en filtros para aislar leucocitos de sangre completa y la solución de ARNlater™ para estabilizar las células en el filtro. Al excluir los glóbulos rojos, el ARN purificado a partir de leucocitos capturados no tiene ARNm de globina, lo que mejora la utilidad de la muestra para el perfilado de expresión y otras aplicaciones (consulte la figura).

Estabilización y captura de leucocitos
Una muestra de 9 a 10 ml de sangre anticoagulada se pasa a través de un filtro LeukoLOCK™, que captura la población total de leucocitos y elimina los glóbulos rojos (incluidos los reticulocitos), las plaquetas y el plasma. Después de enjuagarse con solución salina tamponada con fosfato, el filtro se enjuaga con la solución de ARN later™ para estabilizar el ARN en los leucocitos capturados (consulte el esquema del protocolo). El ARN puede aislarse inmediatamente, o las células estabilizadas pueden mantenerse durante varios días a temperatura ambiente o durante periodos más largos a –20 °C o –80 °C (consulte la figura).

Aislamiento del ARN
La purificación del ARN se realiza primero interrumpiendo las células capturadas en una solución basada en tiocianato de guanidinio que libera el ARN mientras inactiva simultáneamente las nucleasas. El lisado celular se recoge y se trata brevemente con Proteinase K. El ARN se purifica a partir del lisado mediante la tecnología de lavado basada en gránulos magnéticos MagMAX™, seguida por el tratamiento con ADNasa (con TURBO DNase™) y la limpieza final.

Estudios de expresión
Tanto la RT-PCR cuantitativa como los estudios de expresión de micromatrices han validado la idoneidad del ARN purificado para el perfilado fiable del transcriptoma (consulte la figura). En comparación con el ARN procesado con un procedimiento de aislamiento de ARN en sangre de uso común, el ARN aislado con el sistema LeukoLOCK™ produce un ARNa medio más largo después de la amplificación y un porcentaje más alto de llamadas presentes sin necesidad de más pasos posteriores a la extracción para eliminar el ARNm de globina (consulte la figura). Dado que el ARNa de la globina representa un porcentaje del 25 al 40 % del pico de ARNa a partir del ARN total de sangre completa, el rendimiento del ARN total es comprensiblemente inferior con métodos que agotan transcripciones de globina no deseadas. El ARN amplificado después de la purificación con LeukoLOCK™ ofrece una mayor sensibilidad de matriz debida a la drástica reducción en transcripciones competidoras de globina.

Producción del kit
La recuperación varía entre donantes, pero suele ser de 10 a 20 µg de ARN por una cantidad de 9 a 10 ml de sangre completa (consulte la figura). El ARN recuperado mediante el sistema LeukoLOCK™ contiene menos de una décima parte de la cantidad de ARNm de globina alfa y beta derivados de reticulocitos presentes en muestras típicas de ARN de sangre completa no fraccionada.