5(6)-SFX (6-(Fluorescein-5-(and-6)-Carboxamido) Hexanoic Acid, Succinimidyl Ester), mixed isomers

La fluoresceína es un reactivo común de derivatización verde-fluorescente, mientras que los ésteres de succinimidil se utilizan con frecuencia para el etiquetado de las aminas primarias (R-NH₂) de proteínas, oligonucleótidos modificados con aminas y otras moléculas que contienen aminas. Este éster succiniimidil 'sFX' contiene un separador de aminohexanoil de siete átomos entre el fluoróforo y el grupo reactivo. Este espaciador separa el fluoróforo de la biomolécula a la que se conjuga, lo que reduce potencialmente la desactivación que normalmente ocurre al conjugar. Los conjugados de fluoresceína resultantes se pueden detectar con conjuntos de filtros FITC o GFP estándar. Los colorantes a base de fluoresceína y sus conjugados tienen una tasa relativamente alta de fotoblanqueo y una fluorescencia sensible al pH. Alexa Fluor™ 488 y Oregon Green™ 488 son colorantes alternativos cuyos espectros imitan los de la fluoresceína y son mucho más fotoestables con poca o ninguna sensibilidad al pH en el rango de pH fisiológico.

Especificaciones:

• Etiqueta de fluoróforo :

• grupo reactivo de fluoresceína: Éster de succiimidina

• Reactividad: Aminas primarias en proteínas y ligandos, oligonucleótidos modificados con aminas

• Peso molecular: 586

• coeficiente de extinción: 74.000 cm^-1 m^-1

• ex/em del conjugado: 494/520 nm

• colorantes espectralmente similares: Alexa Fluor™ 488, GFP

Reacción de conjugación típica

Los reactivos de reacción de amina pueden conjugarse con prácticamente cualquier proteína o péptido; el protocolo proporcionado está optimizado para anticuerpos IgG. Puede ampliar la reacción para cualquier cantidad de proteína, pero la concentración de la proteína debe ser al menos de 2 mg/ml para obtener unos resultados óptimos. Recomendamos probar tres grados diferentes de etiquetado, utilizando tres proporciones molares diferentes del reactivo a la proteína.

El éster de succinimidil-fluoresceína se suele disolver en dimetilformamida (DMF) o dimetilsulfóxido anhidro (DMSO) de alta calidad y la reacción se realiza en tampón de bicarbonato sódico 0,1–0,2 M, pH 8,3, a temperatura ambiente durante una hora. Debido a que la pKa de la amina terminal es menor que la del grupo epsilon-amino de la lisina, puede lograr un etiquetado más selectivo del terminal de la amina usando un tampón más cercano al pH neutro.

Los anticuerpos etiquetados con purificación conjugados

se separan típicamente del colorante libre usando una columna de filtración de gel, como Sephadex™ G-25, BioGel™ P-30, o equivalente. Para cantidades mucho más grandes o más pequeñas de proteínas, seleccione un medio de filtración en gel con un corte de peso molecular adecuado o purifique mediante diálisis.

Envases alternativos

Los ésteres de succinimidil reactivos con aminas de isómero mixto de fluoresceína también están disponibles en unidades de 10 x 1 mg (F6129), un isómero único (F6106), y con un espaciador más hidrófilo que el espaciador SFX (F6130), así como en numerosos kits para el etiquetado de proteínas y ácidos nucleicos (Ésteres activos y kits para el etiquetado de proteínas y ácidos nucleicos: tabla 1.2).