Champion™ pET101 Directional TOPO™ Expression Kit with BL21 Star™ (DE3) One Shot™ Chemically Competent E. coli

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Champion™ pET101 Directional TOPO™ Expression Kit with BL21 Star™ (DE3) One Shot™ Chemically Competent E. coli

El sistema de expresión pET Champion™ produce proteínas al más alto nivel en E. coli. Durante la expresión, la proteínaMás información

Número de catálogo	Cantidad
K10101	20 reacciones

Número de catálogo K10101

Precio (MXN)

Cantidad:

20 reacciones

El sistema de expresión pET Champion™ produce proteínas al más alto nivel en E. coli. Durante la expresión, la proteína de interés puede alcanzar niveles superiores al 50 por ciento de proteína celular total durante la expresión Basada en vectores de expresión T7 originalmente desarrollados por Studier y sus compañeros (1-3), la expresión de alto nivel se logra porque la ARN polimerasa T7 es más procesiva que la ARN polimerasa de E. coli nativa y se dedica a la transcripción de genes de interés La producción de proteínas se mejora aún más en el sistema por la cepa de expresión BL21 Star™ E. coli, que mejora significativamente la estabilidad de las transcripciones de ARNm y aumenta la expresión de proteínas hasta diez veces.

™ La clonación TOPO direccional simplificada y eficaz permite introducir rápidamente un vector de expresión pET Champion™. Estos kits presentan vectores de expresión de Champion™ pET linealizados activados por topoisomerasa I para la clonación direccional en cinco minutos La tecnología de clonación TOPO™ direccional facilita la expresión porque:

• Una enzima de corrección se utiliza para la PCR, lo que produce menos errores en los genes clonados
• Más del 90 % de los clones están en la orientación correcta para la expresión génica, lo que reduce el tiempo dedicado a la detección de colonias

Están disponibles siete vectores de expresión TOPO™ direccionales pET Champion™ (Figura 1 y Tabla 1): Cada vector porta un promotor T7lac para una expresión de alto nivel. Están disponibles las opciones flexibles para simplificar la detección de proteínas, dividir las etiquetas de purificación, seleccionar los clones portadores de plásmidos y/o mejorar las producciones de proteínas.
Con los vectores TOPO direccionales pET™ Champion™ puede obtener el nivel más alto de producción de proteínas. La Figura 2 muestra la expresión de los vectores TOPO™ direccionales pET Champion™ del gen lacZ. La Figura 3 muestra una división eficaz mediante la proteasa TEV de la etiqueta N-terminal de una proteína de fusión de βgalactosidasa expresada a partir de pET151/D-TOPO™.

Para uso exclusivo en investigación. No apto para uso en procedimientos diagnósticos.

Especificaciones

Resistencia bacteriana a los antibióticosAmpicilina (AMPR)

Cepa bacteriana o de levaduraBL21 Star™(DE3)

Sistema constitutivo o inducibleInducible

Mecanismo de expresiónExpresión basada en células

Sistema de expresiónE. coli

Agente inductorIPTG

Tipo de productoKit de expresión TOPO

Cantidad20 reacciones

Agente de selección (eucariótico)Ninguno

VectorpET

Método de clonaciónTOPO direccional

Línea de productosOne Shot

PromotorT7, lacO

Etiqueta de proteínaEtiqueta His (6x), Etiqueta de epítopo V5

Unit SizeEach

Contenido y almacenamiento

Cada kit de expresión TOPO™ direccional Champion™ pET se suministra como sistema de expresión completo. La caja de expresión TOPO™ direccional contiene 200 ng de vector Champion™ pET linealizado activado por topoisomerasa I; agua estéril; dNTPs; 10 tampones de PCR; solución salina; muestra y primers de control; primers para secuenciación o detección de PCR; y un control de expresión. Almacenar a – 20 °C. La caja One Shot™ TOP10 contiene 21 alícuotas de 50 µl de E. coli químicamente competente, medio SOC y un plásmido de control. Almacenar a - 80 °C. La caja One Shot™ BL21 Star™ (DE3) contiene 21 alícuotas de 50 µl de E. coli químicamente competente, medio SOC y un plásmido de control. Almacenar a - 80 °C. Los kits con tecnología Lumio™ incluyen 20 µl del reactivo de detección Lumio™. Almacenar a – 20 °C. Se garantiza la estabilidad durante 6 meses si se almacena correctamente.

Preguntas frecuentes

My gene of interest is toxic to bacterial cells. Are there any precautions you can suggest?

Several precautions may be taken to prevent problems resulting from basal level expression of a toxic gene of interest. These methods all assume that the T7-based or Champion-based expression plasmid has been correctly designed and created.

- Propagate and maintain your expression plasmid in a strain that does not contain T7 RNA polymerase (i.e., DH5α).
- If using BL21 (DE3) cells, try growing cells at room temperature rather than 37 degrees C for 24-48 hr.
- Perform a fresh transformation using a tightly regulated E. coli strain, such as BL21-AI cells.
- After following the transformation protocol, plate the transformation reaction on LB plates containing 100 µg/mL ampicillin and 0.1% glucose. The presence of glucose represses basal expression of T7 RNA polymerase.
- Following transformation of BL21-AI cells, pick 3 or 4 transformants and inoculate directly into fresh LB medium containing 100 µg/mL ampicillin or 50 µg/mL carbenicillin (and 0.1% glucose, if desired). When the culture reaches an OD600 of 0.4, induce expression of the recombinant protein by adding L-arabinose to a final concentration of 0.2%.
- When performing expression experiments, supplement the growth medium with 0.1% glucose in addition to 0.2% arabinose.
- Try a regulated bacterial expression system such as our pBAD system.

Find additional tips, troubleshooting help, and resources within our Protein Expression Support Center.

I'm trying to express my protein using a bacterial expression system. How do I know if I'm seeing degradation of my protein or if what I’m seeing is codon usage bias?

Typically, if you see 1-2 dominant bands, translation stopped prematurely due to codon usage bias. With degradation, you usually see a ladder of bands. With degradation, you can try using a protease inhibitor and add it to the lysis buffer to help prevent degradation. If degradation is the issue, a time point experiment can be done to determine the best time to harvest the cells.

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I'm trying to express my protein using a bacterial expression system and am getting inclusion bodies. What should I do?

If you are having a solubility issue, try to decrease the temperature or decrease the amount of IPTG used for induction. You can also try a different, more stringent cell strain for expression. Adding 1% glucose to the bacterial culture medium during expression can also help.

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I'm getting low protein yield from my bacterial expression system. What can I do to improve this?

- Inoculate from fresh bacterial cultures, since higher protein yields are generally obtained from a fresh bacterial colony.

- Check the codon usage in the recombinant protein sequence for infrequently used codons. Replacing the rare codons with more commonly used codons can significantly increase expression levels. For example, the arginine codons AGG and AGA are used infrequently by E. coli, so the level of tRNAs for these codons is low.

- Add protease inhibitors, such as PMSF, to buffers during protein purification. Use freshly made PMSF, since PMSF loses effectiveness within 30 min of dilution into an aqueous solution.

- If you are using ampicillin for selection in your expression experiments, you may be experiencing plasmid instability due to the absence of selective conditions. This occurs as the ampicillin is destroyed by β-lactamase or hydrolyzed under the acidic media conditions generated by bacterial metabolism. You may want to substitute carbenicillin for ampicillin in your transformation and expression experiments.

- The recombinant protein may be toxic to bacterial cells. Try a tighter regulation system for competent cell expression such as BL21-AI. You may also consider trying a different expression system such as the pBAD system.

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My cells are growing very slowly, and I'm not getting any protein expression from my baterial expression system. What can I do to fix this?

This typically occurs when your gene of interest is toxic. Try using a tighter regulation system, such as BL21 (DE3) (pLysS) or BL21 (DE3) (pLysE), or BL21(AI).

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