Kit de expresión de Pichia de varias copias

Citas y referencias (2)

Invitrogen™

Kit de expresión de Pichia de varias copias

El kit de expresión de Pichia de varias copias contiene los vectores pPIC3.5K, pPIC9K y pAO815 para la producción yMás información

Número de catálogo	Cantidad
K175001	1 Kit

Número de catálogo K175001

Precio (MXN)

Cantidad:

1 Kit

El kit de expresión de Pichia de varias copias contiene los vectores pPIC3.5K, pPIC9K y pAO815 para la producción y selección de cepas de Pichia que contienen más de una copia del gen de interés. En muchos casos, el aumento del número de copias ha dado lugar a un aumento de los niveles de expresión.

pPIC9K y pPIC3.5K
Los vectores pPIC9K y pPIC3.5K llevan el gen de resistencia a la kanamicina que confiere resistencia al reactivo Geneticina™ en Pichia. La generación espontánea de múltiples eventos de inserción puede identificarse por la resistencia a mayores niveles del reactivo Geneticin™. Los transformantes de Pichia se seleccionan en un medio con deficiencia de histidina y se criban para determinar su nivel de resistencia al reactivo Geneticin™. La capacidad para crecer en altas concentraciones de Geneticin™ indica que hay múltiples copias del gen resistente a la kanamicina y del gen de interés integrados en el genoma (1). El vector pPIC9K dirige la secreción de proteínas expresadas mientras que las proteínas expresadas de pPIC3.5K permanecen intracelulares.

pAO815
pAO815 es un vector de expresión de Pichia diseñado para clonar varias copias de un gen en un solo vector. El vector contiene un sitio Bgl II en el proceso anterior del gen 5´ AOX1 y un sitio único BamH I en el proceso posterior de la señal de la terminación de la transcripción (T) de 3´ AOX1. Se requieren cuatro pasos para generar copias múltiples del gen de interés:
1. El gen se clona en el sitio único EcoR I en el vector.
2. La construcción se digiere con BamH I y Bgl II para liberar el «casete de expresión» que contiene el promotor AOX1, el gen de interés y la TT de 3´ AOX1.
3. Los concatémeros del casete de expresión se generan por ligación in vitro.
4. Las copias múltiples se insertan de nuevo en el vector pAO815 y se transforman en Pichia.

Estos vectores también están disponibles por separado.

Para uso exclusivo en investigación. No apto para uso en procedimientos diagnósticos.

Especificaciones

Resistencia bacteriana a los antibióticosAmpicilina (AmpR), gentamicina (GmR)

Cepa bacteriana o de levaduraKM71

Método de clonaciónEnzimas de restricción/MCS

Mecanismo de expresiónExpresión basada en células

Sistema de expresiónLevadura

Para utilizar con (aplicación)Expresión de proteínas

Tipo de productoKit de expresión

Etiqueta de proteínaSin etiquetar

Cantidad1 Kit

Agente de selección (eucariótico)Ampicilina (AmpR), gentamicina (GmR)

Tipo de célulaCélulas de levadura

FormatoKit

PromotorAOX1

EspecieP. pastoris

VectorpPIC

Unit SizeEach

Contenido y almacenamiento

El kit de expresión Pichia de varias copias incluye 20 µg de cada uno de los vectores pPIC3.5K, pPIC9K y pAO815, cepas de Pichia pastoris GS115 (his4), KM71(arg4 his4 aox1::ARG4), cepa de control GS115 de albúmina, cepa de control GS115 β-gal, kit de transformación Spheroplast, 2 µg de cada cebador de secuenciación de 5´ AOX1, 3´ AOX1 y del factor-α. Los vectores pP1C9K, pPIC3.5K y pAO815 también están disponibles por separado.

Almacene los vectores y primers a -20 °C. Guarde las cepas a temperatura ambiente. Se garantiza la estabilidad de todos los componentes durante 6 meses si se almacenan correctamente.

Preguntas frecuentes

When selecting for blasticidin-resistant transformants in the X-33 strain using pPIC6/pPIC6α vectors, why do I get large and small colonies on YPD plates containing 300 µg/ml blasticidin?

Generally, large colonies represent transformants containing pPIC6/pPIC6α integrants, while small colonies represent transformants containing pPIC6/pPIC6α non-integrants. These non-integrants have transduced the pPIC6/pPIC6α plasmid, and therefore, exhibit a low level of blasticidin resistance in the initial selection process. Upon subsequent screening, these non-integrant transformants do not retain blasticidin resistance.

When choosing a blasticidin-resistant transformant for your expression studies, we recommend that you pick blasticidin-resistant colonies from the initial transformation plate and streak them on a second YPD plate containing the appropriate concentration of blasticidin. Select transformants that remain blasticidin-resistant for further studies.

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My transformation is not working. Do you have any suggestions?

Here are some suggestinos:

- Make sure that you have harvested cells during log-phase growth (OD <1.0 generally).
- If electroporation is being used, see the electroporator manual for suggested conditions. Vary electroporation parameters if necessary.
- Use more DNA.
- Use freshly made competent cells.
- If the LiCl transformation method is being used, try boiling the carrier DNA.

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My spheroplasting of Pichia worked twice, but hasn't worked since. The OD of the culture simply does not drop.

Here are some things to consider:

- If the OD of cells that are used is too high, they will not spheroplast. Do not overgrow cells.
- Do not use old cells and make sure that they are in log phase of growth.
- Make sure to mix zymolyase well before using. Zymolyase is more of a suspension than a solution.
- Make the PEG solution fresh each time and check the pH.

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What are the different kinds of media used for culturing Pichia pastoris and S. cerevisiae?

Following are the rich and minimal media used for culturing Pichia pastoris and S. cerevisiae:

Rich Media:
S. cerevisiae and Pichia pastoris
YPD (YEPD): yeast extract, peptone, and dextrose
YPDS: yeast extract, peptone, dextrose, and sorbitol

Pichia pastoris only
BMGY: buffered glycerol-complex medium
BMMY: buffered methanol-complex medium

Minimal Media (also known as drop-out media):
S. cerevisiae
SC (SD): Synthetic complete (YNB, dextrose (or raffinose or galactose), and amino acids)

Pichia pastoris
MGY: minimal glycerol medium
MD: minimal dextrose
MM: minimal methanol
BMGH: buffered minimal glycerol
BMMH: buffered minimal methanol

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Is there a recommended protocol for fermentation using constitutive expression vectors such as pGAPZ?

Use the following high cell density protocol for pGAP clones. Feed carbon until the desired density is reached (300 to 400 g/L wet cell weight (WCW)). If the protein is well-behaved in the fermenter, increase to 300-400 g/L WCW as with methanol inducible clones. These densities can be reached in less than 48 hours of fermentation. We have fermented constitutive expressers on glycerol using these protocols with good results. Some modifications to the Fermentation Basal Salts Medium that you might want to make are:

1) Substitute 2% dextrose for the 4% glycerol in the batch medium.
2) Substitute 40% dextrose for the 50% glycerol in the fed-batch medium.
3) Feed the 40% dextrose at 12 mL/L/hr (Jim Cregg has published data on expression using several carbon sources as substrates; dextrose gave the highest levels of expression).
4) Yeast extract and peptone may be added to the medium for protein stability.

One warning: If you are working with His- strains, they remain His- after transformation with pGAPZ. Fermentation in minimal medium will require addition of histidine to the fermenter.

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Citations & References (2)

Citations & References

Abstract

Screening procedure for Pichia pastoris clones containing multiple copy gene inserts [In Process Citation]

Authors:Fairlie WD, Russell PK, Zhang HP, Breit SN

Journal:Biotechniques

PubMed ID:10376135

Heteropentameric cholera toxin B subunit chimeric molecules genetically fused to a vaccine antigen induce systemic and mucosal immune responses: a potential new strategy to target recombinant vaccine antigens to mucosal immune systems.

Authors:Harakuni T, Sugawa H, Komesu A, Tadano M, Arakawa T,

Journal:Infect Immun

PubMed ID:16113283

Noninvasive mucosal vaccines are attractive alternatives to parenteral vaccines. Although the conjugation of vaccine antigens with the B subunit of cholera toxin (CTB) is one of the most promising strategies for vaccine delivery to mucosal immune systems, the molecule cannot tolerate large-protein fusion, as it severely impairs pentamerization and loses ... More