Kit de clonación pENTR™/D-TOPO™, con E. coli TOP10 químicamente competente One Shot™

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Invitrogen™

Kit de clonación pENTR™/D-TOPO™, con E. coli TOP10 químicamente competente One Shot™

Los kits de clonación pENTR™/D-TOPO™ emplean una estrategia de clonación extremadamente eficaz de 5 minutos (clonación TOPO™) para clonar deMás información

Número de catálogo	Cantidad
K240020	20 reacciones

Número de catálogo K240020

Precio (MXN)

Cantidad:

20 reacciones

Los kits de clonación pENTR™/D-TOPO™ emplean una estrategia de clonación extremadamente eficaz de 5 minutos (clonación TOPO™) para clonar de forma direccional un producto de PCR de extremo romo en un vector para introducirlo en el sistema Gateway™ o el sistema MultiSite Gateway™. Los productos de PCR con extremo romo se clonan de forma direccional con una eficacia superior al 90 % y sin necesidad de ligasa, procedimientos posteriores a la PCR o enzimas de restricción.

El kit se suministra con todo lo necesario para clonar y seleccionar el gen de interés amplificado de PCR:

• Sistema Gateway™ listo: transporte rápido de los genes clonados entre múltiples sistemas de vectores
• Rápido y fácil: de PCR a Gateway™ en solo tres pasos y en tan solo ∼5 minutos de manipulación
• Eficaz: logra más del 90 % de los clones con el inserto adecuado en la dirección correcta
• Probado: rendimiento fiable durante más de una década

Descripción general de los kits de clonación pENTR™/D-TOPO™

VECTOR	Vector pENTR™/D-TOPO™	Vector de clonación direccional para la entrada al sistema Gateway
MÉTODO DE CLONACIÓN	Clonación TOPO™ direccional	Ligación direccional basada en topoisomerasa I de ∼5 minutos entre productos de PCR de corrección con polimerasa amplificada con extremo romo y el vector
CÉLULAS COMPETENTES	Dos opciones	Elija entre kits con células competentes de crecimiento rápido o alta eficacia

Acceso sencillo al sistema Gateway™
Para acceder al sistema Gateway™, amplifique mediante PCR el gen de interés y añada el producto directamente a la topoisomerasa suministrada y cargada en el vector pENTR™/D-TOPO™, realice una incubación de 5 minutos y transforme las células competentes de E. coli suministradas. Los clones de entrada de Gateway™ que contienen attL están listos para someterse a una recombinación eficaz con los vectores de destino Gateway™ seleccionados.

Vector pENTR™/D-TOPO™ optimizado
El vector pENTR™/D-TOPO™ (Figura 1) incluye emplazamientos de secuenciación de primers M13 y T7, así como emplazamientos de recombinación de attL que flanquean el emplazamiento del inserto del producto de PCR. Esto permite verificar fácilmente la secuencia de los clones y realizar la recombinación deseada de los vectores de destino Gateway™ que contienen attR. Se emplea un gen de resistencia a kanamicina y un origen de pUC para la selección y la propagación de número de copias alto en E. coli.

Clonación direccional simplificada
Gracias a la tecnología de clonación TOPO™, no hay necesidad de realizar acciones como limpieza de PCR, preparación de vectores u otros pasos de manipulación de ADN que consumen mucho tiempo. Solo tiene que añadir su reacción de PCR directamente al vector cargado con la topoisomerasa suministrado, incubar 5 minutos, transformar y obtener clones insertados de forma direccional en hasta un 90 %. Una protuberancia con cuatro bases de los pares del vector con una secuencia de cuatro bases diseñada en el primer directo empleado en la reacción de PCR para ofrecer direccionalidad a la reacción de ligación de la topoisomerasa (figura 2).

La potencia de la tecnología de clonación de recombinación Gateway™
La tecnología de clonación de recombinación Gateway™ sortea las limitaciones de la clonación con restricciones, lo que le permite tener acceso a prácticamente cualquier sistema de expresión en tan solo una hora, con una reacción de recombinación Gateway™ reversible y eficaz al 99 %. La capacidad para mover la misma secuencia de ADN entre distintos vectores sin el uso de enzimas de restricción, ligasa, pasos de subclonación, detección de innumerables colonias o resecuenciación ayudará a ahorrar tiempo, dinero y esfuerzo.

Principales tecnologías de clonación
En el campo de la clonación, la tecnología de clonación TOPO™ y la tecnología de clonación de recombinación Gateway™ han sido unos socios fiables durante más de diez años para miles de científicos. La clonación de TOPO™ y la recombinación Gateway™ rápidas, sencillas y eficaces permiten la clonación rápida y la posterior transferencia de genes entre una amplia variedad de vectores de expresión Gateway™.

Opciones del kit
El kit de clonación pENTR™ /D-TOPO™ se puede adquirir con células competentes TOP10 para clonación estándar o con células competentes Mach1™-T1R para un crecimiento rápido.

Para uso exclusivo en investigación. No apto para uso terapéutico o diagnóstico en animales o humanos.

Para uso exclusivo en investigación. No apto para uso en procedimientos diagnósticos.

Especificaciones

Método de clonaciónTOPO™ direccional

N.º de reacciones20 reactions

Línea de productosOne Shot

Tipo de productoKit de clonación TOPO

Cantidad20 reacciones

VectorpENTR

Unit SizeEach

Contenido y almacenamiento

El kit de clonación pENTR™⁄D-TOPO™ contiene un vector pENTR⁄D-TOPO™, dNTP, solución salina, agua estéril, primers de secuenciación M13 universales, E. coli TOP10 químicamente OneShot™, medio SOC. y un plásmido de control de pUC19. Almacene la E. coli competente a -80 °C. Almacene todos los demás componentes a - 20 °C.

Preguntas frecuentes

Your Gateway-adapted TOPO vectors are supplied with a control template and control primers. Can I obtain the sequence of the control template?

The sequence of the control template is proprietary.

I am using a Directional TOPO Cloning vector for cloning my PCR product. I have screened a bunch of colonies but they all contain my insert cloned in the reverse direction. How can I solve this problem?

Here are possible causes and suggestions:

- Incorrect PCR primer design: Make sure that the forward PCR primer contains the sequence, CACC, at the 5' end. The 4 nucleotides, CACC, base pair with the overhang sequence, GTGG, in the Directional TOPO vector.
- Reverse PCR primer is complementary to the GTGG overhang at the 5' end: Make sure that the reverse PCR primer does not contain the sequence, CACC, at the 5' end.
- Use a thermostable, proofreading polymerase such as Accuprime Pfx DNA Polymerase (Cat. No. 12344024) to produce blunt-end PCR products.

How large of a PCR product can I recombine with a pDONR vector via BP cloning? Does the same apply for TOPO-adapted Entry vectors?

There is no theoretical limit to insert size for a BP reaction with a pDONR vector. Maximum size tested in-house is 12 kb. TOPO vectors are more sensitive to insert size and 3-5 kb is the upper limit for decent cloning efficiency.

How should I clean up my attB-PCR product?

After generating your attB-PCR product, we recommend purifying it to remove PCR buffer, unincorporated dNTPs, attB primers, and any attB primer-dimers. Primers and primer-dimers can recombine efficiently with the Donor vector in the BP reaction and may increase background after transformation into E. coli, whereas leftover PCR buffer may inhibit the BP reaction. Standard PCR product purification protocols using phenol/chloroform extraction followed by ammonium acetate and ethanol or isopropanol precipitation are not recommended for purification of the attB-PCR product as these protocols generally have exclusion limits of less than 100 bp and do not efficiently remove large primer-dimer products. We recommend a PEG purification protocol (see page 17 of the Gateway Technology with Clonase II manual). If you use the above protocol and your attB-PCR product is still not suitably purified, you may further gel-purify the product. We recommend using the PureLink Quick Gel Extraction kit.

I'm getting low cloning efficiency with my directional TOPO cloning reaction. What should I do?

Here are suggestions to try to increase your cloning efficiency with dTOPO cloning:

- Ensure that the 5' primer has CACC and the 3' primer does not have sequence similarity to GTGG.
- The molar ratio of PCR product: TOPO vector used is critical to success.

We recommend using a 1:1 to 2:1 molar ratio, starting with a 1:1 of PCR product: TOPO vector. The TOPO cloning efficiency decreases significantly if the ratio of PCR product: TOPO vector is <0.1:1 or >5:1. These results are generally obtained if too little PCR product is used (i.e., PCR product is too dilute) or if too much PCR product is used in the TOPO cloning reaction. If the yield of the PCR product has been quantitated, the concentration of the PCR product may need to be adjusted before proceeding to TOPO cloning. For pENTR TOPO vectors, using 1-5 ng of a 1 kb PCR product or 5-10 ng of a 2 kb PCR product in a TOPO cloning reaction generally results in a suitable number of colonies.

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Citations & References (9)

Citations & References

Abstract

A novel type of deubiquitinating enzyme.

Authors:Evans PC, Smith TS, Lai MJ, Williams MG, Burke DF, Heyninck K, Kreike MM, Beyaert R, Blundell TL, Kilshaw PJ,

Journal:J Biol Chem

PubMed ID:12682062

A previous report from this laboratory described two novel proteins that have sequence similarity to A20, a negative regulator of NF-kappaB (Evans, P. C., Taylor, E. R., Coadwell, J., Heyninck, K., Beyaert, R., and Kilshaw, P. J. (2001) Biochem. J. 357, 617-623). One of these molecules, cellular zinc finger anti-NF-kappaB ... More

West Nile virus discriminates between DC-SIGN and DC-SIGNR for cellular attachment and infection.

Authors:Davis CW, Nguyen HY, Hanna SL, Sánchez MD, Doms RW, Pierson TC,

Journal:J Virol

PubMed ID:16415006

'The C-type lectins DC-SIGN and DC-SIGNR bind mannose-rich glycans with high affinity. In vitro, cells expressing these attachment factors efficiently capture, and are infected by, a diverse array of appropriately glycosylated pathogens, including dengue virus. In this study, we investigated whether these lectins could enhance cellular infection by West Nile ... More

Identification of an antiangiogenic FGF2-binding site in the N terminus of the soluble pattern recognition receptor PTX3.

Authors:Camozzi M, Rusnati M, Bugatti A, Bottazzi B, Mantovani A, Bastone A, Inforzato A, Vincenti S, Bracci L, Mastroianni D, Presta M,

Journal:J Biol Chem

PubMed ID:16769728

'Long-pentraxin 3 (PTX3) is a soluble pattern recognition receptor with non-redundant functions in inflammation and innate immunity. PTX3 comprises a pentraxin-like C-terminal domain involved in complement activation via C1q interaction and an N-terminal extension with unknown functions. PTX3 binds fibroblast growth factor-2 (FGF2), inhibiting its pro-angiogenic and pro-restenotic activity. Here, ... More

The plant-specific kinase CDKF;1 is involved in activating phosphorylation of cyclin-dependent kinase-activating kinases in Arabidopsis.

Authors:Shimotohno A, Umeda-Hara C, Bisova K, Uchimiya H, Umeda M,

Journal:Plant Cell

PubMed ID:15486101

Cyclin-dependent kinases (CDKs) play essential roles in coordinate control of cell cycle progression. Activation of CDKs requires interaction with specific cyclin partners and phosphorylation of their T-loops by CDK-activating kinases (CAKs). The Arabidopsis thaliana genome encodes four potential CAKs. CAK2At (CDKD;3) and CAK4At (CDKD;2) are closely related to the vertebrate ... More

Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis.

Authors:Kobae Y, Uemura T, Sato MH, Ohnishi M, Mimura T, Nakagawa T, Maeshima M,

Journal:Plant Cell Physiol

PubMed ID:15653794

Cation diffusion facilitator (CDF) proteins belong to a family of heavy metal efflux transporters that might play an essential role in homeostasis and tolerance to metal ions. We investigated the subcellular localization of Arabidopsis thaliana AtMTP1, a member of the CDF family, and its physiological role in the tolerance to ... More

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