EVOS対物レンズの選択ガイド

このガイドは長作動距離（LWD）対物レンズについて説明します。ガラス品質（AchroとFLとApo）、位相差、LWDおよびCC、最適な容器厚などの動的イメージングパラメーターを考慮して、顕微鏡に最適な対物レンズを選択する方法について説明します。

このガイドは、以下のような客観的なマーキング、画像品質、サンプルタイプおよびアプリケーションについて疑問がある研究者を支援します。下記は一例となります。

1. さまざまなサンプル、アプリケーションおよび顕微鏡に最適な対物レンズの選択（特に容器のマッチングに重点を置いています）
2. ガラス品質の意味、最適な容器の厚さ、および画質への影響を明確化
3. 顕微鏡対物レンズの鏡筒のマークの定義
4. さまざまなアプリケーションに最適なガラスタイプ（Achro、Fluorite、Apochromat）を選択
5. カバースリップ補正（CC）と長作動距離（LWD）対物レンズの違いを理解
6. Achromat（Plan）、Achromat phase（Plan pH）、Fluorite（FL）、Fluorite phase（FL pH）およびApochromat（Apo）対物レンズから選択
7. サンプル容器に使用する40xおよび60x LWD対物レンズを決定します

高品質な画像を生成するには、適切な顕微鏡対物レンズの使用が不可欠です。しかし、これは異なるタイプ、クラス、価格範囲を持つ目的の間の選択によって複雑になる可能性があります。これらの情報の多くは、対物レンズの鏡筒に刻まれたマークに記載されており、それらを理解することで、選択が容易になります。現代のほとんどの対物レンズの鏡筒には様々なマークが含まれており、その中には広く理解されているもの（倍率、開口数（NA））もあれば、最適な容器の厚さのようなものもある （カバースリップを介したイメージング用の対物レンズでは通常0.17 mm、プラスチック容器内のサンプルのイメージング用に設計された対物レンズでは1.0 mm）は、多くのユーザーにとって透明性が低くなります。この記事の目的は、一般的に使用される鏡筒のマークを簡単に解釈することで、多くの客観的なオプションをナビゲートし、画質と関連するトレードオフの主な決定要因を強調することです。

あまり知られていないかもしれませんが、最適な容器の厚さは画質に大きな影響を与える可能性があります。顕微鏡の対物レンズは、長作動距離（LWD）とカバースリップ補正（CC）の2つの主要なクラスに分けられます。2つのクラスのうち、CC対物レンズは、カバースリップの下にマウントしたサンプル、またはガラス底ディッシュに培養したサンプルを使用して優れた画像品質を実現しますが、厚い基板を介してイメージングする能力は制限されています。そのため、LWD対物レンズは 、プラスチック製ディッシュ、フラスコ、またはマルチウェルプレートのサンプルに必要です。

CC対物レンズは、一般的に認められている厚さ0.17 mmの顕微鏡カバースリップを通してイメージングするように設計されており、一般的には「1.5カバースリップ」と見なされています。 LWD対物レンズは、0.8 mm以上のさまざまな厚さの細胞培養ディッシュなどの厚いサンプル容器で使用するように設計されています（図1）。この設計仕様は 、対物レンズのバレルには∞/--、∞/ 0.17 mm、∞/ 1.0 mm、または∞/1.2 mmの碑文が記載されている。与えられた例では、∞/-指定の対物レンズは幅広い容器の厚さにわたって使用できますが、∞/0.17 mmまたは∞/1.0 mm指定の対物レンズは、それぞれ0.17 mmまたは1.0 mmの厚さの容器での使用に最適です。この最適な設計仕様から逸脱すると、画質が低下し、シャープな焦点が得られない「ソフト」なぼやけた画像になります。

 生物科学のイメージングアプリケーションでは厚さ0.17 mm（#1.5）カバースリップが一般的に使用されているため、∞/0.17 Cの対物レンズを最適な容器に一致させることは、一般的に簡単です。しかし、フラスコ、ディッシュ、プレートなどの一般的に使用されるプラスチック容器間の厚さのばらつきにより、∞/1.0または∞/1.2 LWD対物レンズを最適な容器に一致させることは困難です。細胞対応プラスチック容器のメーカー間およびメーカー内の厚さは、厚さが約0.8mm~1.6mmの範囲です。LWD対物レンズを選択する際に容器の厚さと対物レンズの適合性が考慮されない場合、結果は画質が大幅に低下します。この効果は、40xや60xなどの高倍率で特に顕著であり、目的の設計を容器の厚さに合わせることが不可欠になります。

2倍から20倍の倍率では、被写界深度は十分に大きいため、LWDアプリケーションで厚さの異なる容器間で画像品質が大きく変化することはありません。これはラベル ∞/-によって示される。 しかし、40xと60xでは被写界深度が浅く、最適な画質を確保するためには目的を容器の厚さに合わせることが不可欠です。したがって、これらの目的には、∞/1.0 mmまたは∞/1.2 mmの専用の容器厚さマークがあります(図2)。

対物レンズのバレルにあるマークが示すように、∞/1.0mm LWD対物レンズは、厚さが約1.0 mmの容器を介したイメージング用に設計されています。 一方、∞/1.2mm LWD対物レンズは、公称厚1.2 mmの容器を介したイメージング用に設計されています。最適な結果を得るために、標準的な顕微鏡スライドおよび厚さ <1.2 mmのプラスチックディッシュでイメージングする場合は、1.0 mm補正対物レンズを使用してください、 厚さが1.2 mm以上のプラスチック製ディッシュでイメージングする場合は、1.2 mm補正された対物レンズを使用してください。ただし、前述のように、容器の厚さは異なる場合があります。 したがって、一般的にイメージングされる容器の厚さを経験的に決定し、このデータを使用してラボ用に購入する目的を決定することが重要です。

∞/-指定はLWDアプリケーションに特に適用されることに注意することが重要です。つまり、さまざまな厚い容器を介したイメージングを意味します。カバースリップを介してイメージングする場合は、専用の∞/0.17 mm CC対物レンズを推奨します（図3）。専用のCC対物レンズが利用できない場合は、LWD対物レンズを使用してカバースリップを通してイメージングすることは推奨されません。最良の結果を得るためには、スライドを裏返してスライドを画像化することをお勧めします。顕微鏡法での一般的な誤解は、カバースリップを介したイメージングでは常に最良の画像が得られるということです。 これはCC対物レンズにも当てはまりますが、下図の例は、基板の厚さと対物レンズの設計が不一致であるため、LWD対物レンズの最良の方法ではないことを示しています（図3）。

容器の厚さの不一致による球面収差（ぼやけた画像）を回避することに加えて、色収差に関する客観的な分類、または単一の焦点面内で異なる色（波長）を焦点に合わせる能力を考慮する必要があります。この補正係数は、客観的設計の「分類」によって指定されます。LWD対物レンズで一般的に使用される分類は、plan Achromat（Achro）、plan Fluorite（FL）、plan Apochromat（Apo）で、それぞれが収差補正と画像品質に関して一定レベルの性能を約束します。Achromatは、一般的に「Plan」または「Plan Ph」対物レンズは、2つの波長（青、赤）を単一の焦点面に導入するように設計されており、FL対物レンズは2～4波長（青、緑、赤）を単一の焦点面に導入するように設計されており、Apo対物レンズは4～5色の色収差補正を提供します。画像品質は、光が通過する培地にも影響されるため、Apo対物レンズは一般的にカバースリップとガラス底容器にのみ推奨されます。

3つの対物レンズクラスはすべて磁場の曲率に対して平面（Plan）補正が可能ですが、蛍光顕微鏡法にはFLおよびApo対物レンズのみが適しています。そのため、Achro対物レンズは透過光顕微鏡検査にのみ推奨され、透過白色光を使用した明視野または位相差イメージングに推奨されます。一方、Fluorite対物レンズとApoは、マルチカラー蛍光や明視野、位相差イメージングに使用できます。優れた補正により、Achromat対物レンズと比較して大幅に向上した画像品質を持つ画像を生成します。

EVOS顕微鏡では、Achro対物レンズとFL対物レンズの両方に、透過光を使用した位相差イメージング用の内部位相リング（Plan PHおよびFL PH対物レンズ）が付属しています。顕微鏡コンデンサーの環状体（図4）と組み合わせることで、位相差は明視野照明と比較してコントラストが向上し、通常、コンフルエンスや形態、増殖、生存率などを評価するために細胞培養環境で未染色細胞の可視化に使用されます。

しかし、対物レンズ内の位相リングも光スループットを大幅に低下させるため、蛍光標識されたターゲットの輝度とコントラストが大幅に損なわれます。したがって、これらのトレードオフを考慮して、位相差によって得られる潜在的な利点と、蛍光における性能の低下を比較検討することが重要です（図 5）。 単一の40x Fluorite phase対物レンズは汎用性が高く、40x Achro PHおよび40x Fluorite対物レンズを個別に購入するよりも安価ですが、画像品質のトレードオフは大きくなる場合があります。そのため、FL PH対物レンズは、同じ実験で位相差と蛍光が必要なアプリケーションにのみ推奨されます。推奨されていない場合は、Achro PH対物レンズとFL対物レンズの混合セットがより望ましい場合があります。

対物レンズ選択フローチャート（図6）は、アプリケーションに最適なEVOS LWD対物レンズを決定するのに役立ちます。ご不明な点がある場合は、 テクニカルサポート担当者 または最寄りの営業担当者にお問い合わせください。

要約すると、さまざまな顕微鏡対物レンズが利用可能であり、特定のサンプルとアプリケーションに最適な選択は、いくつかの技術的要因によって異なります。価格は数百ドルから数千ドルまで様々で、多くの場合、実際に考慮する必要があります。画像品質に影響を与える要因(コントラスト、S/N比、解像度など)、および客観的なクラスとタイプを説明する用語を理解することで、十分な情報に基づいた意思決定ができ、実験の目的に適したデータをより簡単に生成できます。