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Columnas para HPLC
Cuando la muestra entra en la trayectoria del flujo, la fase móvil transporta la muestra hasta la columna, donde se produce la separación.
Las columnas pueden funcionar a temperatura ambiente, pero generalmente se controlan mediante termostato y se guardan dentro de un compartimento de columna con control de temperatura. Es esencial un control adecuado de la temperatura de la columna para mantener la precisión del tiempo de retención, la selectividad y la eficacia de separación.
Como regla general, está bien recordar que a medida que aumenta la temperatura de la columna, disminuye la retención de los analitos, lo que conlleva una separación más rápida.
Componentes del sistema de HPLC
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Funcionamiento de las columnas para HPLC
Representación de una mezcla de muestras que es eluida y separada en la columna a velocidades distintas.
Las columnas para HPLC contienen una fase estacionaria unida a un material de apoyo, que normalmente son partículas de sílice porosas, para proporcionar un área grande de la superficie. La fase estacionaria constituye la base para separar los componentes de la muestra.
La composición química de la fase estacionaria dicta la afinidad de los componentes de la muestra a la hora de pegarse o conservarse en la columna según la fase móvil va empujando la muestra a través de la columna. Como resultado, los componentes de la muestra atraviesan la columna y eluyen a diferentes velocidades.
Por ejemplo, visualice una mezcla (A) que contiene varios componentes representados como una banda gris introducida en la parte frontal o en la cabeza de la columna.
A medida que la fase móvil transporta la mezcla a través de la columna, el componente rojo (B) se conserva en mayor medida que el morado. Como resultado, los componentes morado y azul se mueven más rápido a través de la columna y son las primeras «bandas» que eluyen de la columna (C). Las bandas verde, amarilla y roja se conservan durante más tiempo y eluyen más tarde (D).
Elegir la columna para HPLC adecuada
Las propiedades fisicoquímicas de una muestra, la composición química de la fase estacionaria, la composición de la fase móvil y el caudal y la temperatura de la columna determinan la velocidad a la que los componentes se desplazan a través de la columna. Los investigadores pueden elegir entre varias sustancias químicas para la fase estacionaria y entre distintas dimensiones de columna, como la longitud, el diámetro interior y los tamaños de las partículas complementarias.
Tipo de columna | Fase estacionaria | Fase móvil | Aplicaciones |
Fase reversa (RP) | No polar, como el C18 o el fenilo | Mezcla de agua y disolvente orgánico polar | Representa la mayoría de las separaciones mediante HPLC |
Fase normal (NP) | Polar, como el sílice libre | Mezcla de disolventes orgánicos menos polares | Muestras e isómeros insolubles en agua |
Interacción hidrófila (HILIC) | Polar, como la fase enlazada de amida o sílice | Mezcla de agua y disolvente orgánico no polar | Muestras altamente polares que no se conservan bien mediante la cromatografía de líquidos de fase reversa |
Intercambio iónico (IEX) | Grupos ionizables | Normalmente una solución acuosa de una sal junto con un tampón | Muestras ionizables y biomoléculas grandes |
Par de iones | Columnas de fase reversa no polares | Condiciones no polares junto con un reactivo de emparejamiento de iones | Ácidos o bases que no se conservan bien en fase reversa |
Quirales | Grupos quirales como polisacáridos o ciclodextrinas | Dependen del analito y la especificidad de la proteína, pueden ser de fase reversa, fase normal, orgánica polar, etc. | Separación/purificación de enantiómeros, como mezclas racémicas de fármacos |
Interacción hidrófoba (HIC) | Cadenas de alquilos cortas y no polares o fenilo | Gradiente de tampón alto en sal, condiciones de no desnaturalización | Proteínas, a menudo anticuerpos |
Exclusión por tamaños (SEC) | Una columna inerte, como un polímero dextrano | Se utiliza con una fase móvil acuosa u orgánica | Biomoléculas grandes o polímeros sintéticos |
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Preguntas frecuentes
Las columnas para HPLC más habituales son de acero inoxidable y están empaquetadas con partículas de sílice porosas que suelen modificarse como, por ejemplo, una unión C18, que es una opción frecuente para las HPLC de fase reversa. Sin embargo, existe una gran variedad de hardware y material para empaquetar las columnas para HPLC.
Antes de comenzar un nuevo análisis, valore las propiedades físicas y químicas de los analitos, el modo de análisis y la forma en que los analitos interactuarán con la superficie de la fase cromatográfica.
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