高效液相色谱(HPLC)故障排查：为何信噪比(SNR)决定检出限

在我的日常工作中，检测器的设置和参数越来越得不到足够的关注和重视。

但在告诉你关于正确数据速率及相关时间常数设置的最佳实践，或者紫外检测器狭缝宽度设置如何影响色谱结果之前，我想先强调一个理论上不太复杂的话题：信噪比（SNR）.

原因很简单，SNR是解释大多数与检测器相关的关联或相互关系的关键。关于检测器设置的最佳实践，在其他多种资料中已有充分描述。你只需查阅相应的检测器手册，使用Thermo Scientific™ Chromeleon™ 色谱数据系统(CDS)中的检测器向导或帮助功能，或者在网上搜索即可。

为什么信噪比是最重要的数据参数？

在分析化学中，主要任务并不总是检测和定量主要组分。

相反，重点往往是检测痕量与超痕量水平的物质，如污染物、杂质或降解产物，例如用于过程监控或环境筛查分析。在许多情况下，样品中关注物质浓度范围差异很大。

如果某种物质的检测信号无法与分析方法不可避免的基线噪声充分区分——也就是说信号与噪声相近甚至更小——则该物质将无法被检出。这就是为什么SNR（信噪比）决定了液相色谱法（LC）检出限的直接原因。

在质量控制中，尤其是在制药和生物制药分析领域，必须在主要成分（如活性药物成分）旁检测杂质。即使检测器线性决定了目标分析物的校准范围，也就是主要成分与杂质从最低到最高浓度的工作区间，SNR仍然定义了检出限，特别是对于杂质而言。

应用简报170：使用UHPLC-DAD进行快速奈韦拉平杂质分析展示了一个很好的例子：在较低SNR条件下，结合Thermo Scientific™ Vanquish™ 二极管阵列检测器HL（DAD HL）的优异线性范围。这使得可以在单次运行中将杂质定量至0.008%相对面积！

如果无法优化分析方法——也就是说无法增加样品物质信号或降低分析过程中的基线噪声——则可以采用数学信号处理方法来平滑基线噪声。

但必须清楚，原始数据会被修改——既被人为处理。主要有两种处理方式：在数据采集过程中或在数据采集之后进行。

使用滤波器（如紫外检测器中的时间常数）来平滑测量信号是一种常见做法。对于大多数检测器来说，时间常数（名称可能不同，如响应时间或上升时间，这些往往是换算后的时间常数）本质上就是一种电子滤波器，用于降低基线噪声。

在相同的数据采集速率下，不同的时间常数会导致不同的基线噪声水平。在这种情况下，将时间常数从2.00秒更改为0.01秒时，基线噪声水平增加9倍。那么，你现在是否认为使用2.00秒的时间常数总是最佳选择，因为基线噪声被降到最低？

将时间常数设置为较高值可能会因过度平滑而导致数据丢失。为什么？

尤其是接近基线噪声水平的小信号，会在高度上被大幅压低（并在宽度上变宽），同时也被平滑掉。因此，低浓度物质经过滤波后可能不再被“检出”，因为它们不再满足检出限标准（稍后解释）。

此外，原始数据是在应用了时间常数滤波器后采集的，这意味着该滤波器无法在数据采集后“关闭”或更改，以检查较小峰值。

赛默飞世尔科学 ISQ™ EC 和 EM 单四极杆质谱仪拥有一个色谱过滤器功能该过滤器应用高斯平滑滤波器，以减少由电子或检测器噪声引入的检测峰值的人为信号变化。

它还会去除所有低于某一阈值的信号，这些信号被认为是电子或检测器噪声。

只有超过该阈值的信号才会被记录。

若满足积分条件，峰面积保持不变。

是否有不会因过度平滑而导致数据丢失的替代方法？

有！高斯卷积、Savitsky-Golay平滑、傅里叶变换或小波变换等数学函数都可用于后续降噪处理。原始数据保持不变（前提是计算过程中未覆盖或删除原始数据）。

与高斯曲线的卷积源于自相关分析，可用于在基线噪声中进行峰检出，例如在背景信号——更准确地说在检测器基线——中对某物质进行定性检出。

每个CDS都使用公式和函数，从原始数据中计算并可视化结果。例如，Chromeleon软件提供了：利用Cobra和SmartPeaks实现智能积分Cobra 峰检出算法可简化积分，并采用自适应Savitsky-Golay平滑函数在不丢失关键信息的情况下去除基线噪声。SmartPeaks积分助手能够帮助快速且直观地对未分离峰进行积分。

在进一步的数据评估步骤中应用高斯卷积、傅里叶变换或小波变换，可以成为任何分析流程的重要组成部分。正确且谨慎地使用这些方法，可以消除背景噪声而不会造成数据丢失。

傅里叶变换被应用于多种分析检测技术，从光学（如UV-VIS）到核磁共振（NMR）光谱学。其中非常著名的是傅里叶变换红外（FTIR），它被用于FTIR光谱法，同时也用于FTIR显微镜。

你知道吗？赛默飞
™ Orbitrap™液相色谱质谱系统是基于傅里叶变换离子回旋共振技术的吗？傅里叶变换用于将捕获离子的信号频率转换为实际的质谱图。

小波变换被视为傅里叶变换的进一步发展。除了降噪之外，它还可以成功用于峰值分辨，从较大的峰中提取或分离出较小物质的峰值。.

通常情况下，数据平滑不宜过度。

当平滑因子过大或多次平滑时，虽然基线噪声会按预期降低，但物质信号高度也可能降低，从而导致信号宽度增大。信号（更准确地说峰值）可能展宽到与检测器基线融合的程度，变得不可见、不可检出。然而，由于原始数据被保留，您可以撤销数据平滑步骤，或者应用其他可能带来更好结果的滤波函数。这种尝试可以作为制定标准操作规程（SOP）过程中数据评估环节的一部分。

然而，由于原始数据被保留，您可以撤销数据平滑步骤，或者应用其他可能带来更好结果的滤波函数。这种尝试可以作为制定标准操作规程（SOP）过程中数据评估环节的一部分。

过度平滑是否会造成这种数据破坏，取决于信号相对基线噪声的高度——也就是初始 SNR。当SNR接近检出限（LOD）时，通常最好的方法是收集更优质的数据，这样只需进行一次或无需进行数据平滑。

现在让我们更详细地了解一下检测限（LOD）和定量限（LOQ）。

从信噪比（SNR）到检测限（LOD）和定量限（LOQ）

SNR 可作为判断指标，用于估计某物质信号是否能在检测器基线中被识别、从而在样品中可被检出。

一种方法的灵敏度和检出限由测量系统的噪声决定。噪声指的是所有不需要的、统计性波动的信号，这些信号叠加在测量信号上。.

对于表现出基线噪声的分析程序，可以通过SNR估算检出限（LOD）和定量限（LOQ）。典型例子包括色谱法和光谱法。根据 ICH质量指南 Q2(R1)用于检出限和定量限的确定LOD和LOQ可以基于信噪比（SNR）以及目视评估进行确定：

• LOD是指在与空白运行的基线噪声相比时，能够可靠检测到物质信号的最低样品浓度。通常认为信噪比在2:1到3:1之间适用于检测限的估算。（下一版ICH Q2修订，即计划于2023年5月实施的Q2(R2)，在当前草案中指出：“一般认为3:1的信噪比适用于检出限的估算。”因此，未来2:1的信噪比将不再被接受。）
• LOQ是指在与空白运行的基线噪声相比时，能够可靠定量物质信号的最低样品浓度。典型的信噪比为10:1。（截至本文发布时，ICH Q2(R2)中未提及 LOQ 的变化。）

ICH指南已由巴西ANVISA（RDC 166/2017和RDC 413/2020）、欧洲委员会（CPMP/ICH/381/95）、美国FDA（第62卷，第96期，第27463-7页）、新加坡HAS（分析验证指南）、加拿大卫生部（15-106599-601）、韩国MFDS（0213-01指南）、日本MHLW/PMDA（PMSB/ELD通知第338号）、中国NMPA（公告第7号[2020]）、瑞士Swissmedic（ICH指南自动适用），以及中华台北TFDA（分析验证指导原则）实施。

在更多国家/地区的实施仍在推进中。

HPLC中的SNR、LOD和LOQ

分析方法采用稳健参数开发，因此即使在略有不完美的分析条件下也能重复获得结果——因为分析结果必须可靠。

基线噪声被定义为空白运行色谱图基线上最大点与最小点之间的差值。HPLC中的SNR根据基线数值计算。

通常，当前色谱图或之前空白运行中的无峰区段用于确定基线噪声。然后将该基线噪声（平均高度）与物质的信号高度进行比较。这就是关键所在。

检出限或定量限是指峰值或物质信号必须至少高出基线多少倍的噪声高度。它可以根据具体要求有所不同，通常基于分析方法的实际应用条件与场景。

在多年支持各应用领域广泛客户、且常常处于受监管环境中时，我发现LOD和LOQ的最低信噪比要求比ICH指南更严格，尤其是在更具挑战性的色谱条件下。

作为经验法则，在真实样品与分析条件下，常见的实际要求是：

• LOD 的 SNR 在 3:1 到 10:1 之间
• LOQ 的 SNR 在 10:1 到 20:1 之间

最后的话

希望你能看到，在讨论数据结果质量时，SNR 是最重要的指导指标。

提升 SNR 有多种办法，但如果通过平滑数据来降低基线噪声，可能会导致极低浓度物质在平滑后不再被检出。较小的物质峰会被压平，直到它们可能不再能从检测器基线上区分出来。

在分析方法中应用数据过滤或降噪功能之前，请先检查在较少甚至不使用数据过滤情况下 SNR 是否足够，以免丢失分析结果的细节。

如图所示，有时进一步提高信噪比（SNR）可能并没有意义。

从图片来看，SNR = 80 似乎是最清晰的图片，但在 SNR = 20 时，所有细节都已经可以充分看见。

此外，在 SNR = 80 时，这条街道看起来像一条柏油路，但实际上它是一条沙土路。这一细节信息在 SNR = 20 时可能会更清楚。

在 SNR = 8 时，没有人会认为这条路是铺了柏油的，而且大多数重要细节已经足够清晰可见。

附加信息

使用 UHPLC-DAD 快速分析奈韦拉平杂质
使用Cobra和SmartPeaks进行的智能积分
ISQ EC & EM小贴示——色谱滤波的影响