Absolute Q数字PCR系统在转基因成分定量检测中的应用

Absolute Q数字PCR系统可用于转基因成分定量检测。本文结合实验流程、重复性与定量限结果，展示该平台在GMO检测中的应用表现。

简介

• 数字PCR是否适合用于转基因成分的绝对定量检测。
• QuantStudio Absolute Q数字PCR系统如何支持GMO样品检测。
• 在3%、1%、0.1%、0.05%、0.01%等不同水平下，重复性、再现性和定量限表现如何。
• 这一方案适合哪些农业食品检测与方法开发场景。

要点概览

• 数字PCR无需依赖标准曲线，可用于转基因成分绝对定量。
• Absolute Q采用芯片式数字PCR路线，流程集成度高，适合标准化检测工作流。
• 文中实验显示该系统在多个 GMO 含量梯度下具有良好的准确性、重复性与再现性。
• 定量限可达到0.01%水平，适合低丰度样本检测场景。

背景

转基因技术是利用基因工程手段将外源基因导入生物体基因组并使之表现出预期性状的技术，该技术用于现代农业生产后，培育了许多具有抗病虫、耐除草剂、抗非生物胁迫、品质改良等优良性状的转基因植物。随着转基因技术的发展和转基因生物(Genetically Modified Organism, 简称GMO)的日益普及，转基因产品进入市场的种类和数量越来越多，为保护消费者的知情权，我国颁布实施了转基因产品的标识制度。为了保障转基因标识制度的顺利实施，建立精确有效的检测方法尤为重要，对于检测方法定量的准确性提出了很高的要求[1]。数字PCR是一种不依赖于标准物质和标准曲线能对核酸进行绝对定量的检测技术，在转基因作物及其产品的定量检测，以及转基因检测标准物质的研制中的应用越来越广泛[2]。

2017年2月28日发布，2017年9月1日实施的国标 GB/T 33526-2017《转基因植物产品数字PCR检测方法》中规定了转基因成分检测的数字PCR方法，适用于玉米、大豆、油菜、水稻、马铃薯、苜蓿、棉花等转基因植物及其产品的转基因成分数字PCR检测，所能达到的检测低限为0.1%。国标中指出，数字PCR其技术原理是通过将原始PCR反应体系进行分割，进而对所有小的反应体系进行扩增并后续检测。通过对反应体系进行有限的分割，从而使整个反应体系可以更加耐受核酸抑制因子，并且更加稳定、准确、快速地对痕量的转基因成分进行精准鉴定。其中微滴式数字PCR的油包水分割方式的稳定性较差，而且对于数据分析的要求也相对较高，而芯片式数字PCR通过微流控芯片实现对原始反应体系的分割，这种分割方式具有稳定性好、均一性好的优点。Applied Biosystems QuantStudio Absolute Q芯片式数字PCR系统采用芯片式数字PCR原理，能够简洁、快速、准确地完成转基因的检测和定量。

QuantStudio Absolute Q数字PCR平台

数字PCR(dPCR)是一种全新的核酸检测和定量方法。数字PCR是将一份样品分配到数万个反应单元中，而这些反应单元中只有部分含有目标分子。在经过PCR扩增和信号分析后，采用泊松分布来计算样品中目标分子数，无需标准品即可完成绝对浓度的定量。

对于需要高灵敏度、高精度和准确度的检测，QuantStudio Absolute Q数字PCR系统是一种理想选择。QuantStudio Absolute Q是基于微流体阵列式芯片的数字PCR系统，该系统将液滴生成、液滴扩增和数据分析集成到一体化仪器中，其实验流程如同qPCR实验一般，实现在1.5小时内从样本到数据结果的快速简便工作流程。系统采用具有专利的微流体阵列式芯片技术。相比于其他数字PCR平台，该系统可在20480个固定纳米级微孔中生成95%以上的有效反应液滴，具有更少的死体积（上样体积与实际分析体积之差），从而获得更精准的实验结果。

检测方法

探针引物设计

QuantStudio Absolute Q数字PCR系统使用的探针引物无特别之处。国家标准和行业标准中针对qPCR技术推荐的各种探针引物也同样适用于数字PCR。如果您手头有qPCR日常检测用的探针引物以及样品，即可以开展QuantStudio Absolute Q数字PCR实验。本实验的探针引物如下：

样品准备

在本实验中，我们分别采用转基因玉米DBN9858品种转基因成分含量100%的标准物质DNA与DBN9858非转基因受体的DNA进行混合，制备转基因成分含量在3%、1%、0.1%、0.05%水平的样本；转基因玉米DBN9936品种转基因成分含量5%的标准物质DNA与DBN9936非转基因受体的DNA进行混合，制备转基因成分含量在3%、1%、0.1%、0.05%、0.01%水平的样本，以验证QuantStudio Absolute Q数字PCR系统在定量及定性检测转基因成分含量方面的精密度和灵敏度性能。本实验DBN9858、DBN9936标准物质DNA及对应的非转基因受体DNA均由中国农业科学院油料作物研究所提供。

数字PCR反应体系配制

QuantStudio Absolute Q数字PCR系统支持5个荧光检测通道，在转基因成分定量检测中，就可以实现同一检测孔中，对转基因元件和内源基因进行双重靶标检测。

上样芯片板运行实验

一、反应体系配制及准备：按上表配制反应体系，充分混合反应体系，10,000 x g离心1分钟。

二、将反应体系加至QS Absolute Q MAP16芯片板：握住MAP芯片板的框架，在平整、无尘的平面上操作。每个孔加入一个反应体系。以45°角，将9µL的dPCR反应体系加入孔底。仅使用移液器至第一档即可。以45°角，加15µL分离封闭缓冲液。仅使用移液器至第一档。在MAP芯片板上盖上5个芯片胶垫。

三、设置运行：选择已装载的MAP芯片列；设置PCR参数。96℃预热10分钟；96℃ 5秒；60℃ 15秒，循环数40；选择荧光通道。确定芯片胶垫方向，使A标记在芯片顶部，选择“开始”，运行实验。QuantStudio Absolute Q Digital PCR Software控制分析软件，可轻松编辑板面布局、荧光通道和热循环程序等参数，可以快速运行实验。

实验结果

仪器运行结束后用户可用QuantStudio Absolute Q Digital PCR Software查看数据结果，软件界面可以查看MAP16芯片板对应的每个检测孔的有效微孔数据、阴阳性孔的分布和数目，并计算样本对应检测靶标的拷贝数浓度。

重复性实验结果

本实验中，转基因成分含量(GMO%)=(外源基因拷贝数浓度/内源基因拷贝数浓度)x100%[3]。采用DBN9936、DBN9858 GMO%在3%、1%水平的样本分别进行12次重复检测，检测结果如表2所示，GMO%实际测量值分别为3.64%、1.21%，符合预期，表明QuantStudio Absolute Q数字PCR系统定量检测准确性好。统计分析12次重复检测结果的相对标准偏差(relative standard deviation; RSD)均小于3.26%，远小于欧盟转基因检测网络实验室(European Network of GMO Laboratories，ENGL)在文件中要求的检测方法相对标准偏差不超过25%[3]，表明QuantStudio Absolute Q数字PCR系统定量检测重复性非常好。图3为转基因成分含量1%水平的样本数字PCR检测结果示例，阴阳性反应微孔分群明显，阴性对照NTC无阳性微孔。

再现性实验结果与定量限结果

本实验针对DBN9936、DBN9858转基因成分含量1%、0.1%、0.05%的样本使用相同仪器、试剂，不同操作人员分别进行重复性实验，评估仪器对转基因成分定量检测的再现性。具体实验结果如表3所示。DBN9936和DBN9858转基因成分含量1%水平的样本每次检测12个复孔，重复两次实验，两次实验结果转基因成分含量相对标准偏差RSD均小于5%；DBN9936和DBN9858转基因成分含量0.1%和0.05%水平的样本每次检测6个复孔，重复两次实验，转基因成分含量相对标准偏差均小于13.83%，检测结果符合欧盟转基因检测标准。DBN9936和DBN9858转基因成分含量1%、0.1%和0.05%水平两次实验批次间定量结果一致性高，转基因成分含量相对标准偏差均小于25%，表明QuantStudio Absolute Q数字PCR系统定量检测再现性好。

定量限是能够准确定量的最低浓度水平，通过DBN9936转基因成分含量0.01%水平的样本进行12次重复检测，检测结果如表4所示。DBN9936转基因成分含量0.01%水平的样本外源基因拷贝数浓度均值为2.19 copies/µL，相对标准偏差RSD为17.77%；zSSIIb内源基因拷贝数浓度均值为14226.52 copies/µL，相对标准偏差RSD为3.83%；12次重复检测转基因成分含量实际检测均值为0.015%，检测结果符合预期浓度水平，说明定量检测结果准确。12次重复检测转基因成分含量检测结果的相对标准偏差RSD为20.18%，符合欧盟转基因检测要求，表明QuantStudio Absolute Q数字PCR系统对于转基因成分含量检测的定量限可以达到0.01%水平。

结论

传统荧光定量PCR能够进行转基因成分的定性和定量，但其不足也较为明显：DNA样品需要较高的品质要求，定量结果要求PCR反应的效率接近100%，标准品价格较贵，绝对定量标准曲线的实验较繁琐，且对于低浓度的GMO混杂样品检测灵敏度不高。而数字PCR已被证实对DNA样品中的PCR抑制物不敏感，而且对于低浓度的样品定量也非常准确。

本实验DBN9936和DBN9858转基因成分含量在3%、1%、0.1%、0.05%水平的样本转基因成分含量实际定量值与预期水平基本一致，并且对应的相对标准偏差RSD远小于25%，符合欧盟转基因检测标准，表明QuantStudio Absolute Q数字PCR系统定量检测结果准确度高、重复性好。QuantStudio Absolute Q数字PCR系统对于转基因成分含量检测的定量限可以达到万分之一水平，这将使得数字PCR在转基因成分定量及定性检测领域具有很高的实际应用价值。

文中涉及产品

参考文献

1. 游英华, 赵志, 李亚楠, 宋治国, 常洪雷, 等. 数字PCR在转基因植物检测中的应用[J]. 中国生物防治学报, 2022, 38(5):1143-1148.
2. 斯能武, 李俊, 武玉花, 吴刚, 张丽, 等. 数字PCR在转基因定量检测中的研究进展[J]. 中国油料作物学报, 2021, 43(1):40-50.
3. Hougs L, Gatto F, Goerlich O, et al. Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods. EUR 29015 EN, Publication Office of the European Union, Luxembourg, 2017. DOI: 10.2788/87679.