技术指南｜如何利用Attune Xenith流式细胞仪的光谱解析功能提高免疫表型分析的准确性？

免疫表型分析是通过流式细胞术检测细胞表面或内部的特定抗原标记物，用于疾病诊断（尤其是血液肿瘤分型）和细胞功能研究的一项检测技术。高维多色流式方案的精准解析主要受流式细胞仪硬件系统的性能和样本质量的影响。

本技术指南主要探讨了样本质量与数据采集稳定性对实现深度免疫表型分析的重要性，并重点介绍了Attune Xenith全光谱流式细胞仪在应对这些挑战中的卓越性能。

所用仪器

• Invitrogen™ Attune™ Xenith™ 全光谱流式细胞分析仪
• Invitrogen™ Countess™ 3 FL 自动细胞计数仪

优化样本制备流程，保证样本质量

为了有效减少细胞聚集和避免靶标异常表达，需从样本采集到数据获取全流程实施标准化操作。死细胞、游离碎片及损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）都会干扰下游免疫表型分析。

改进样本消化和酶处理步骤可以提升样本质量。研究人员应系统地考虑样本制备流程中组织解离、细胞裂解、酶处理及纯化步骤的优化（图 1）。梯度离心等细胞碎片去除方法必需平衡样本处理时间、成本以及对细胞活性和细胞群的影响。具体操作方法应根据组织类型、目标细胞群及分子靶标的生物学特性进行相应调整。

图 1. 减少细胞聚集和DAMPs的推荐实验步骤，随后再进行免疫表型染色。对于组织消化物，尽可能减少手动剪切次数，或是避免过度化学处理。该流程经证实处理脾脏样本的效果很好，包括DNase酶处理和过滤环节。

使用死活细胞染料，进行样本质量控制

为了确保样本质量，建议在样本制备与数据采集阶段都进行死活细胞分群分析。使用Countess 3 FL自动细胞计数仪，可在2分钟内快速评估细胞样本（仅需少量样本，≤10 µL）。在流式实验方案中加入细胞活性染料，通过设门去除死细胞：该质量控制步骤极为关键，尤其是对于原代组织和肿瘤样本。

图2. 小鼠脾细胞样本质量不高，使得流式实验结果不准确。数据采集过程中观察到的细胞黏联体/聚集体及很多碎片（红色箭头指示）为细胞样本碎片。这些现象表明样本整体质量有问题，可能导致抗原表达异常。此外，低质量细胞有时很难通过圈门（此处指单细胞门、目标区域(Region of interest, ROI)和活细胞门）完全排除，因此容易引发后续分析误差。LIVE/DEAD NIR876为Invitrogen™ LIVE/DEAD™ Fixable NIR 876细胞活性染料（货号 L34980）。

稳定地数据采集极为重要

通过时间参数动态图（time plots）评估上机采集的稳定性，有助于获得可靠数据。这类图表可在样本采集或数据分析步骤中生成。图 3数据表明，即使在样本质量欠佳（即图2小鼠脾脏低质量样本）的情况下，数据采集过程仍保持高度稳定。

尽管样本质量欠佳，Attune Xenith全光谱流式细胞仪仍展现出卓越的数据采集稳定性，从而确保实验结果的可靠性与可重复性。

图3. 通过时间参数动态图评估数据采集的质量。当必须使用质量欠佳的样本时，数据采集过程的质量控制十分重要。时间与散射光通道的时间参数动态图可以来检测各种异常情况，比如经常容易发生管路堵塞的样本。在本案例中，这里用到了组织消化样本，含有很少的活细胞。后续的数据处理工具和时间相关的设门策略能够优化采集结果。这些样本表现出了稳定的采集速率，这些时间/散射光参数相关流式图可以在数据采集或分析步骤中生成。

样本质量对光谱解析结果的影响

Attune Xenith全光谱流式细胞仪的声波聚焦技术能够有效处理容易堵塞的样本，但需注意的是样本质量依然严重影响数据结果（图 4）。

图4. 样本质量对蛋白表达谱的影响。从小鼠骨髓中分离CD19+ B220+ B细胞，比较不同细胞亚群的活性水平。(A) 在表面标志物染色前，该样本通过细胞计数和台盼蓝拒染法显示死细胞比例较高。在流式分析中该样本表现出异常的蛋白表达谱。(B) 相同样本处理分析条件下，高活性的样本细胞表现出正常蛋白表达谱。因此，即使通过设门策略来去除碎片和死细胞，样本中的细胞活性质量缺陷仍会导致高维多色光谱数据出现异常信号。Real Blue 780为Real Blue™ 780荧光染料。Brilliant Ultra Violet 661为Brilliant Ultra Violet™ 661荧光染料。

结论

要实现深入的免疫表型分析，需严格把控样本质量与数据采集的稳定性。Attune Xenith全光谱流式细胞仪凭借其先进的光学检测系统和液流设计，即便面对复杂样本也能提供卓越质量的数据。建议提前评估样本质量：在样本制备初期阶段（即染色前），使用Countess 3 FL自动细胞计数仪进行快速细胞计数和活性检测，以避免过多的细胞碎片或死细胞给后续染色和分析带来的影响。

在实验流程的各个阶段，通过建立数据质量检查点、不断优化样本处理流程，研究人员可以充分发挥流式细胞仪性能，稳定获得优质的流式数据，从而得到稳定可靠的免疫表型分析结果。

所用试剂与耗材

实验步骤

试剂制备

注：所有试剂均应在4 ℃下使用，除非生产商另有说明。

1. 红细胞裂解液：将1份eBioscience 10×红细胞裂解液加到 9份超纯水中，制备裂解工作液。使用前，于4 ℃保存。
2. 细胞培养基：将1份热灭活优质胎牛血清加到9份RPMI 1640培养基中进行制备。多次颠倒混匀，于4 ℃下使用。
3. DNase工作液：a. 将冻干DNase I溶解于超纯水中，配制成5 mg/mL的储存液。按照厂家说明书将其分装，于-20 ℃储存。b. 将1份5 mg/mL的DNase I储存液加到49份细胞培养基中，制备终浓度为100 µg/mL的DNase I工作液。于4 ℃下使用。
4. LIVE/DEAD细胞活性染料工作液：a. 按照该染料的说明书，向管中加入50 μL DMSO，以溶解 LIVE/DEAD Fixable NIR 876细胞活性染料。b. LIVE/DEAD Fixable NIR 876染料应进行滴定，来优化活/死细胞分群效果和避免背景干扰。建议使用1× PBS缓冲液，以1:1000的稀释比例为起始梯度来滴定。

样本消化与染色

注：本实验方案适合3个脾脏的实验材料使用量。根据具体的组织解离步骤，适当调整试剂的用量。

1. 取3个新鲜的小鼠脾脏。
2. 将小鼠脾脏放入含5 mL HBSS缓冲液（Hanks’ 平衡盐溶液）的培养皿中。
3. 使用刀片或手术刀，小心将脾脏切成小块（~0.2 cm²）。若只进行简单的细胞分离，直接进行第5步。
4. 髓系细胞制备如下：在37°C下，使用5 mL含IV型胶原酶（100 U/mL）和1% FBS的DNase（20 μg/mL）的HBSS溶液消化小块状的脾脏，孵育20–30分钟。然后加入1 mM/mL EDTA，在室温下消化5分钟后，终止酶消化反应。
5. 将细胞筛放在50 mL离心管上方。
6. 使用一次性移液器，将消化后的脾组织转移到细胞筛上。
7. 使用注射器柱塞端，捣碎或碾碎脾脏，使其通过筛网。如有需要，加入5–10 mL PBS冲洗。
8. 用适量的PBS冲洗细胞，使其通过筛网。如有必要，重复第5、6步。
9. 于4 ℃以400×g离心5分钟，随后轻轻倾倒弃去上清液。
10. 将细胞沉淀重悬于1 mL细胞培养基中，轻轻吹打混匀。
11. 加入3 mL红细胞裂解液，室温孵育3分钟，期间偶尔轻轻摇动。
12. 加入20 mL DNase 消化液以终止裂解，并通过降解游离DNA防止细胞聚集成团。
13. 轻轻颠倒细胞悬液数次使其混匀，经70 μm细胞滤网过滤至新的50 mL锥形管中。
14. 于4 ℃以400×g离心5分钟，随后轻轻倾倒弃去上清液。
15. 将细胞沉淀重悬于10 mL DNase消化液中，轻轻吹打混匀，于4 ℃孵育15分钟。
16. 细胞计数，确定合适的重悬体积（参见后续步骤）。
17. 加入20 mL细胞培养基，颠倒混匀。
18. 于4 ℃下以400×g离心5分钟，随后轻轻倾倒弃去上清液。
19. 将细胞重悬于10 mL细胞培养基中，轻轻吹打混匀。
20. 加入20 mL细胞培养基，颠倒混匀。
21. 于4 ℃下以400×g离心5分钟，随后轻轻倾倒弃去上清液。
22. 根据上述计数结果，将细胞重悬于流式染色缓冲液中，调整活细胞浓度为3×10⁷个活细胞/mL。
23. 加入小鼠CD16/32单克隆抗体（每100 µL细胞悬液添加1 µL），于4 ℃孵育5分钟。
24. 制备混合活/死细胞悬液用于死活染料单色染色对照管：a. 将100 µL细胞悬液于65 ℃中热激5分钟；b. 将热激处理的细胞快速冷却至4℃，随后加入50 µL新鲜细胞悬液，制备活/死细胞混合对照样本。
25. 向各预标记管中加入适量抗体或抗体预混液。
26. 每支样本管和对照管中加入100 µL细胞悬液（3×10⁶ 个细胞），轻轻吹打混匀。注：使用第19步制备的混合活/死细胞作为活/死细胞单染对照样本。
27. 于4 ℃下避光孵育30分钟。
28. 向每份细胞悬液中加入3 mL 1× PBS。
29. 于4 ℃下以400×g离心5分钟，随后轻轻倾倒弃去上清液。
30. 将每份细胞沉淀重悬于3 mL 1× PBS中，轻轻吹打混匀。
31. 于4 ℃下以400×g离心5分钟，随后轻轻倾倒弃去上清液。
32. 将每份细胞沉淀重悬于100 µL流式染色缓冲液中，轻轻吹打混匀。
33. 向完全染色的样本、相应的FMO对照及活/死细胞对照中加入 10 µL的LIVE/DEAD工作液。
34. 于4 ℃下避光孵育20分钟。
35. 向每份细胞悬液中加入3 mL流式染色缓冲液。
36. 于4 ℃下以400×g离心5分钟，随后轻轻倾倒弃去上清液。
37. 将每份细胞沉淀重悬于3 mL 流式染色缓冲液中，轻轻吹打混匀。
38. 于4 ℃下以400×g离心5分钟，随后轻轻倾倒弃去上清液。
39. 将每份细胞沉淀重悬于100 µL流式染色缓冲中，轻轻吹打混匀。
40. 立即进行上机检测，或进行后续的细胞固定破膜步骤，检测细胞内的蛋白靶标表达。

注：LIVE/DEAD可固定细胞活性染料适用于新鲜样本，并且在多种固定剂中都能保持稳定。若使用其他细胞活性检测染料，需要在预实验中提前进行测试，确保细胞固定前后死活细胞染色效果一致。

微球对照制备

1. 按照说明书制备UltraComp eBeads Plus补偿微球。

2. 添加流式细胞内固定破膜缓冲液到微球中，或是立即上样分析。

注：微球对照的样本处理方式应与染色的细胞对照一致。因此，若对单染对照和样本进行了固定和/或破膜处理，则需对微球对照使用相同的实验流程。

Invitrogen™ Attune™ Xenith™ 是赛默飞全新推出的一款快速且抗堵的全光谱流式细胞仪，将声波聚焦专利技术与全光谱解析功能完美结合，旨在为前沿的科学研究提供一种高效、灵敏、可靠的解决方案。

其主要技术优势为：

• 全光谱：配置高达6激光57参数
• 速度快：上样速度比其他光谱流式仪快5倍
• 抗堵：专业抗堵塞设计
• 灵敏：尤其适合稀有细胞检测
• 自动化：配套流式自动化工作站