多重与单重 qPCR

多重扩增的优缺点

如何、何时以及是否要对您的qPCR实验进行多重扩增

在设计定量PCR（qPCR）实验时，最常见的问题之一就是是否可以在单次反应中扩增多个目标序列。这被称为多重扩增，好消息是——确实可以实现。不过，这也带来了一些挑战，需要解决这些问题才能确保实验成功。在Taq Talk视频系列的第22和23集，我们回顾了关于如何、何时以及是否要对您的qPCR实验进行多重扩增的一些必备知识。

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比较与对比

单重扩增

首先，单重扩增（每个反应只扩增一个目标）要比简单得多多重扩增。实时PCR协议通常都是围绕单重实验设计的，因此切换到多重扩增需要对协议进行调整。单重扩增还具有明确性，即每个反应只扩增一个目标序列，不会出现不同的扩增事件相互干扰或结合，从而导致结果复杂化。

多重扩增

多重扩增提供了一些重要的优势，这些优势绝对值得考虑。当多个目标序列在同一个反应中被扩增时，可以显著节省主混合试剂。孔数减少一半或更少，就意味着总染料、dNTP等的用量也减少一半——这种成本节约对许多实验室来说非常有吸引力。

此外，移液操作有时会导致所有qPCR反应之间的总体积不完全一致。例如，在将目标基因与参考基因分别进行单重扩增分析时，这可能成为一个问题。

在一次多重扩增实验中，多个基因在同一个反应中被分析，因此各目标之间的体积必须相同。需要填充的孔数更少，使得多重扩增实验的设置速度远快于等量单重扩增反应的设置。

然而，由于qPCR通常应该采用相同条件下的三重复反应，即使是单重扩增实验也内置了监控移液精度的方法。因此，多重扩增很少（甚至几乎不会）成为强制要求，但如果能够妥善处理其复杂性，它仍然可以带来大量的试剂和时间上的节省。

相关视频: 单重与多重qPCR的注意事项——Taq Talk第23集

优化多重qPCR实验

目标序列要求

要从多重实验中获得优质数据，需要特别小心。每个目标序列都需要专属的染料和相应的探针，并且该染料必须具有独特的发射波长，以便您的qPCR仪器能够检测并区分。染料选择也非常重要：Applied Biosystems™ SYBR™ Green试剂盒仅适用于单重反应，因为SYBR Green染料会结合所有PCR产物。而使用Applied Biosystems™ TaqMan™ Assays时，可以通过标记不同荧光基团（如FAM™和VIC™染料）的探针轻松区分各个目标。任何Applied Biosystems™实时PCR仪器都能区分这些染料。

但请注意——仅仅将所有这些组分放在一个反应体系中，可能还不足以获得优质数据。当两个反应共享一个孔时，即使它们拥有不同的探针，也会争夺dNTP、酶以及其他反应组分（见图1）。

如果某个基因（通常是内源性对照）比另一个先开始扩增，它可能在另一个基因出现在扩增曲线之前就进入线性和平台期。此时，目标基因会因试剂供应不足而扩增效果较差，导致结果无法解释（见图2）。

figure 1 competition for reaction components in real-time PCR assay with reaction wells — 图1. 实时PCR分析中对反应组分的竞争。中心显示的是三重复反应孔。

figure 2 early amplification of endogenous control resulting in poor amplification of target gene — 图2. 内源性对照提前扩增导致目标基因扩增效果不佳。

相关视频:如何优化多重qPCR实验——Taq Talk第22集

你很幸运——避免这个问题其实非常简单。如果某个目标可能会在试剂竞争中胜过另一个目标，可以对该目标进行引物限制。显著降低对照基因的引物浓度，会让其信号更早达到平台期，从而更容易区分两个信号，并为感兴趣的实验基因保留更多其他试剂。

双基因多重检测

要判断两种基因多重检测的难易程度、选择哪个基因进行引物限制，以及两种染料是否真正兼容多重检测，需要一些测试样本。首先从你的实验组和对照组各选5-6个样本，在双重和单重配置下分别运行。如果大多数样本在两种配置下的读数差异很小，则可以安全地将剩余实验以多重方式进行。如果两种读数不一致，说明以多重方式运行实验可能导致数据不稳定甚至无法使用。如果样本数量有限或制备耗时较长，避免风险可能更为可取。

高阶多重检测

在高阶多重检测中也应保持同样的谨慎态度。Applied Biosystems™实时PCR仪器配备了多个滤光片组，可让你在单次反应中实现多个引物和探针的多重检测。然而，单次反应中的目标越多，它们之间的相互作用就越复杂，结果被某种方式偏离的风险也越大。

Applied Biosystems™ TaqMan™ 检测系统采用强大、高度特异且极其灵活的实时PCR技术。用户可以选择不同染料的TaqMan探针，这使他们能够自信且成功地在单孔内实现多个目标的多重检测。

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观看本文引用的视频

» 如何优化多重qPCR实验 – Taq Talk第22集

 » 单重与多重qPCR实验注意事项 – Taq Talk第23集

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