サンガーシーケンス用のプライマーは、Applied Biosystems™ Primer Designer™ ツールのようなオンラインツールを使用することで、簡単にデザインできます。では、ヒト個人識別のような、特殊なアプリケーションのプライマーデザインはどうでしょうか?
今回は、Thermo Fisher ScientificのシニアスタッフサイエンティストであるJulio Muleroへの2015年のインタビュー内容を紹介します。Julio Muleroのグループ は、24の遺伝子座を同時に増幅するApplied Biosystems™ GlobalFiler™ PCR Amplification Kitなど、ヒト個人識別用の製品を開発しました。
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法医学市場向けのマルチプレックスキットの開発要件を教えてください。
当社は27-plexまでのPCRベースのキットを開発していますが、特殊な開発要件があります。当社のアンプリコンは、長さが70~400 bp になるようにデザインされています。これは、キャピラリー電気泳動で1 bpの分解能を実現するための最適な領域です。また、解析できる遺伝子座の数を最大化するために、Applied Biosystems™ 3500 ジェネティックアナライザのような 6色素に対応した機器を使用します。私たちのデザインのターゲットとなる個々の遺伝子座は政府機関によって決定されており、これらの遺伝子座は国によって異なることがあります。ある集団では非常に有意な遺伝子座が、他の集団ではそうではないこともあります。これに対し、Applied Biosystems™ GlobalFiler™ PCR Amplification Kitは、最も有意で広く使用されている遺伝子座を、世界中で使用できる 1つのマルチプレックスに統合したものになります。
GlobalFiler PCR Amplification Kitは 24-plexになりますが、27-plexの製品は何ですか?
Applied Biosystems™ Yfiler™ Plus PCR Amplification Kitは、27-plexの製品です。Y染色体は、減数分裂時に組み換えを受けないため、その多様性は突然変異によって生じます。このキットは、大量のバックグラウンドDNA(女性)のなかで、非常に少量の Y DNA(男性)の識別が必要となる性的暴行事件のために開発されました。バックグラウンドに対するY DNAの比率は、1000分の1という低い比率になることもあります。

図. 1:1000男性/女性混合サンプルのデータ例
Powerful discrimination plus optimal performance with the Yfiler Plus PCR Amplification Kit (thermofisher.com)より抜粋
さらに、プライマー同士の相互作用やオフターゲット増幅を最小限に抑えなくてはなりません。法医学分野では、PCR 阻害剤に強いマスターミックスが求められますが、安定性やスタター※形成といった他の性能とのバランスをとりながら解決するのは難しい問題です。
※STRのような繰り返し配列に対し、DNAポリメラーゼが伸長中にスリップすることで引き起こるPCR増幅のアーチファクト
PCRマスターミックスの最適化も必要なのでしょうか?
はい、最適化は必要です。プライマーデザインの指針として、バイオインフォマティクスを活用していますが、デザインしたものが性能パラメーターを満たしているかの確認で、ラボ作業に代わるものはありません。当社はプライマーのデザインと PCRマスターミックスの調合に 10 年以上の経験がありますが、サンプルの遺伝子型の解釈に影響を与えるアーチファクト(スタターなど)を最小限に抑えながら、お客さまが最も重視するパラメーター (前述したY-STR への特異性や、数ピコグラム量のDNAの感度など)を最適化するために、何度も繰り返し検証する必要があります。
プライマーデザインには、リアルタイム PCR も含まれますか?
Applied Biosystems™ Quantifiler™ Trio DNA Quantification KitとQuantifiler™ HP DNA Quantification Kitは、私たちのグループが法医学アプリケーション用に開発した製品です。これらは、法医学サンプルからピコグラム量のDNAを正確に定量できるようデザインされており、同時に、DNAの分解やPCR阻害など、DNA の品質に関する追加情報も提供します。この情報は、後の工程で、サンプルをどのように処理するかの指針となるため、お客さまにとって大きな価値があります。
(インタビュー終了)
今回は、ヒト個人識別用のマルチプレックスキットを開発した当社サイエンティストへのインタビューをご紹介しました。
Quantifiler Kit、GlobalFiler Kit、YFiler Kitは、研究用、法医学用、親子鑑定用にのみ使用できます。診断には使用いただけません。