検量線をひかずに定量する比較Ct法とは？｜今こそ本気で徹底理解! リアルタイムPCR講座第13回

年々、進化し続けるリアルタイムPCR。一昔前は当たり前だったやり方が、必ずしも最適とは言いきれない場合も出てきています。その1つの例が、検量線法です。

リアルタイムPCRで検量線をひく場合、先ずは標準サンプルを測定し、作成したスタンダードサンプル検量線をもとにサンプルの定量を行います（図１）。

図1：標準サンプルの検量線から未知サンプルの濃度を求める方法（検量線法）

このような検量線法は、増幅効率を反映するため、正確な定量結果を得ることができます。しかし近年は、より効率的な実験ができる「比較C_t法（⊿⊿C_t法）」が、検量線法に代わって研究現場でつかわれるケースが増えてきています。

比較C_t法の一番の特徴は、「検量線をひかなくとも良い」ということです。標準サンプルの測定をおこなわず、内在性コントロールでサンプル間の補正をし、相対定量します。検量線作成のために使用する試薬の量を減らすことができ、実験の操作も少なくてすみます。多サンプルを処理できるメリットもあるので、コツをおさえて、ぜひ活用いただきたいです。

TS白神

なるほど。では、比較C_t法の原理をみていきましょう。

比較C_t法とは、基準となるサンプル（キャリブレーター）と比較して、未知サンプルが何サイクル早く、あるいは何サイクル遅くThreshold Lineに到達するかを検出し、相対定量する方法です。検量線法で必要とされる標準サンプルの測定はいりません。

そもそもリアルタイムPCRの定量が、“増幅産物がある量に達するのに、PCRを何サイクルおこなったかがわかれば、初期量がわかる”という理論に基づくことを覚えていますか?テンプレートの初期量をサイクル数というものさしで計るのが、リアルタイムPCR。つまり、テンプレート間でPCR反応を1サイクルまわすことで生じる増幅産物の量の差は、初期テンプレート量の違いを反映しています。

ここで大事なのは、PCRの増幅効率が1であれば、増幅曲線が1サイクル早く立ち上がることはテンプレートの初期量が2倍である、逆に1サイクル遅く立ち上がるとことはテンプレートの初期量が半分である、という法則が成り立つことです（図2）。