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Dynabeads®磁珠的特性

Dynabeads®磁珠是一种大小均一、无孔、超顺磁的、单分散的、高度交联的聚苯乙烯微球,整个磁珠由均匀分散的磁性材料构成。该磁性材料由磁赤铁矿(γ-Fe2O3)和磁铁矿(Fe3O4)的混合物组成。在Dynabeads®磁珠M-280和M-450中,铁(Fe)分别占磁珠重量的12%和20%。Dynabeads®磁珠表面覆盖有一层薄的聚苯乙烯外壳,将磁性材料包裹在内,可防止磁珠泄漏或在内部捕获配体。此外,该外壳也可避免目标分子直接接触铁,同时为每次实验提供特定的表面来吸附或偶联各种分子。

磁珠尺寸和形状均一,确保物理和化学性质稳定一致,进而提高实验结果的质量和可重复性。

Dynabeads®磁珠分为3种不同尺寸:4.5 μm (M-450磁珠),2.8 μm (M-270/M-280磁珠)和1 μm (MyOne™磁珠)。

 

我们提供甲苯磺酰基、环氧基、羧基和胺基活化的Dynabeads®磁珠。请点击链接查看不同磁珠的对比信息。

磁珠的密度很难测量。这是因为Dynabeads®磁珠含有17–37%的磁性氧化铁,具有一定的磁分离时间,其中氧化铁的密度约为4.9。Dynabeads®磁珠为复合材料,是聚合物与氧化铁的混合物,而聚合物的密度很少低于1。沉降速度与磁珠直径的平方成正比,所以1 µm磁珠的沉降速度远低于2.8 µm磁珠。磁珠越小,磁性分离所需的氧化铁含量越高,这在一定程度上抵消了尺寸减小所带来的效应。通常,M-280磁珠的密度为1.4,1 µm磁珠的密度为1.8。另外,水相密度的增加,也应会降低沉降速度。

只有未包被的环氧基或甲苯磺酰基活化的磁珠可根据需要使用70%乙醇进行清洗除菌。包被的磁珠不可灭菌。

一般来说,在加入配体包被磁珠时,短时间超声是减少磁珠聚集、确保磁珠获得最佳均一性的好方法。一旦目标分子结合到磁珠,就要加倍小心了,以防结合被破坏。链霉亲和素磁珠本身能够承受超声。超声5分钟是可以的,更长时间超声的影响还未被测试。关于链霉亲和素-生物素的相互作用可否被超声破坏目前也尚无相关信息。

原材料磁珠已经经过6,000 rpm离心测试。尚未测试过更高转速。然而,Dynabeads®磁珠很紧密,聚合物基体的多孔被磁性材料填充,而且最外层又包被了聚合物外壳,进一步增强了磁珠的硬度。因此,离心的压力理论上不会对磁珠本身造成影响,但磁珠对周围细胞产生的力可能会伤害细胞。

这取决于涂层或生物素化分子的特性。我们建议您通过测试来确定针对特定实验的最佳条件。

对于所有溶剂来说,是否和Dynabeads®兼容主要取决于溶剂的浓度和孵育时间。磁珠本身可以与多种不影响氧化铁沉淀的溶剂兼容,例如:

乙醇(70%乙醇实际上可用于对磁珠进行灭菌和清洗)、甲醇、丙酮、异丙醇、二甘醇二甲醚、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈和四氢呋喃(THF)。THF与二甘醇二甲醚相似,适用于Dynabeads®磁珠。

能,Dynabeads®磁珠能够兼容6–8 M的尿素。

连二亚硫酸盐是一种还原剂。此外,连二亚硫酸盐离子对二价和三价金属离子(M2+、M3+)的亲和力很强,使之能够增强铁的溶解度,因此可作为一种有效的螯合剂。但是Dynabeads®磁珠中的铁会被连二亚硫酸盐还原并脱离。如果Dynabeads®磁珠暴露于DTT和EDTA,也会出现相同的情况。因此,连二亚硫酸盐、DTT和EDTA不能与Dynabeads®磁珠兼容。

Dynabeads®磁珠——概述

Dynabeads®磁珠有3种尺寸:4.5 µm (M-450)、2.8 µm (M-270/M-280)和1 µm (MyOne™ beads)。其中最大尺寸的磁珠非常适合细胞等较大的目标,2.8 µm磁珠推荐用于蛋白质组学和分子研究,而最小的1 µm磁珠则适用于自动化处理。

有多种不同的方法可以检测配体与磁珠结合,包括光密度(OD)检测、荧光标记和放射性标记。

对于OD检测,应在配体固定到磁珠上之前检测配体的OD值,并将其与包被后上清液中剩余的配体浓度进行比较。这样可以粗略检测有多少蛋白与磁珠结合。

实验方案:

  1. 将分光光度计设置到正确的波长。使用偶联缓冲液作为空白组。
  2. 检测偶联前溶液的吸光值。根据配体的加入量,可能需要进一步稀释以读取吸光值。
  3. 检测偶联后溶液的吸光值。也可能需要进一步稀释以读取吸光值。
  4. 计算偶联效率,以“蛋白质摄取量%”表示,如下所示:[(偶联前溶液的吸光值x D) – (偶联后溶液的吸光值x D)] x 100/(偶联前溶液的吸光值 x D),D = 稀释倍数。

对于荧光标记,我们建议对配体结合量进行反向定量,即检测偶联上清液中剩余的配体量(与原始样本对比),而不是直接检测磁珠上的配体量。将标记的配体加入到磁珠中,并检测上清液中剩余多少配体(而不是结合到磁珠上的配体)。通过与开始时加入的总配体量相比,可以计算出结合到磁珠上的配体量。由于Dynabeads®磁珠具有自发荧光,因此,我们不推荐直接检测与磁珠结合的配体的荧光,而是推荐这种间接方法。标记物可以是FITC/PE等。有些研究人员也成功使用了直接检测方法(采用流式细胞仪)。

在3种方法中,放射标记的灵敏度最高,但难度最大。该方法涉及到对配体的一部分进行放射性标记。在偶联前,使用示踪剂量的放射性标记的I-125,将其以一定比例与“冷”配体混合。使用闪烁(γ)计数器对磁珠进行检测,并将磁珠的cpm值与标准品对比,得到磁珠上配体的绝对量。

实验方案:

  1. 取出适量磁珠,并使用1 mL结合缓冲液清洗。
  2. 吸取适量人IgG,置于一个单独的管子中。
  3. 将人IgG与I-125标记的人IgG(30,000–100,000 cpm)混合。
  4. 使用结合缓冲液将人IgG与I-125标记的人IgG混合物稀释至100mL。
  5. 室温下孵育30分钟,使用闪烁计数器检测cpm值。
  6. 清洗磁珠(和包被层)4次,再次检测cpm值。
    使用下述方程计算结合率%:(清洗后cpm值/清洗前cpm值)x100%。

M代表磁性,280和270表示磁珠的直径,两者均为2.8 µm。M-280是指疏水的2.8 µm磁珠,而M-270是指亲水的2.8 µm磁珠。MyOne™是指1 µm的磁珠。

磁化率能够衡量磁珠向磁力架迁移的速度,其大小取决于铁含量和氧化铁的特性。Dynabeads®磁珠的磁化率是指质量磁化率,单位可以是cgs单位/g或m^3/kg(国际单位制)。对于亚铁磁性和铁磁性物质,质量磁化率取决于磁场强度(H),这些物质的磁化强度与H不是线性关系,而是随着场强增加而趋于饱和。因此, Dynabeads®磁珠的质量磁化率是在固定条件下由标准操作程序而测定的。我们产品目录中给出的质量磁化率是国际单位制。磁化率由从高斯(cgs、emu)单位向国际单位的转换,是通过“高斯系数(emu/g或cgs/g)x 4π x 10^-3”而实现的。所得单位也被称为合理化质量磁化率,与(国际单位制)无量纲磁化率单位有所区别。通常,质量磁化率可用来衡量在非均匀磁场中影响物体的力(Fz)。测定Dynabeads®磁珠的质量磁化率时,首先对样本称重,然后将样本放置于已知强度的磁场中。随后,再次称重得到样本重量(F1),并与关闭磁场时样本的重量(F0)进行对比。使用下述公式计算磁化率:K x 10^–3 = [(F1-F0) x m x 0.335 x 10^6],K表示质量为m的样本的质量磁化率。最后,将磁化率转换为国际单位制。

所有Dynabeads®磁珠都是配体包被或表面活化的,也就是说磁珠表面都具有化学功能。

( 1) 惰性最强的磁珠是Dynabeads® M-270磁珠和Dynabeads® MyOne™羧基活化磁珠。它们需要被激活(使用EDC)才能与分子发生共价反应。存在的问题是,这些磁珠可能形成团块或聚集,在中性pH条件下难以处理(在pH值约为5-6时更容易处理)。

(2) Dynabeads® M-270 Epoxy磁珠在水溶液中孵育可失活(这也是它们冻干运输的原因),这些磁珠与水接触时(所需孵育时间未知,但相当长),会因为水解作用而变成惰性磁珠。(请注意,Dynabeads® M-450 Epoxy磁珠更稳定,因为它是以疏水性更强的颗粒为基础)。在Tris缓冲液中孵育(至少在室温下孵育4小时),也能有效阻断环氧基。使用Tris将会增加氨基,为了减少这种作用,将包被的磁珠在乙醇胺中孵育过夜可能会更好(0.1M,60℃孵育1小时,或37℃孵育过夜)。这也会使环氧基失活。此外,使用高浓度的NaOH水溶液(0.5M,60℃孵育1小时,或37℃孵育过夜)孵育,也能够加速水解作用。除了残留的环氧基团,磁珠表面的化学基团也能引起分子吸附。

(3) 磁珠越小(更不稳定),惰性越强。

(4) 仅使用Tris阻断活性基团,就可能使甲苯磺酰基活化的磁珠(Dynabeads® M-280 Tosylactivated磁珠和Dynabeads® M-450 Tosylactivated磁珠)失活。但是,前两个方法可能更有效。

可以,Dynabeads®磁珠可用于分离单链DNA。链霉亲和素Dynabeads®磁珠能够以生物素化的DNA片段为靶标,通过使双链DNA变性,从而去除非生物素化链。链霉亲和素偶联的Dynabeads®磁珠不会抑制任何酶活性。因此,可以在固相上直接对磁珠结合的DNA进行下一步处理。请点击以下链接,查看关于单链DNA捕获的更多信息。

对于小于1 kb的生物素标记DNA,我们推荐使用Dynabeads® M270链霉亲和素磁珠和MyOne™ C1磁珠。对于大于1kb的双链DNA分子,我们推荐Dynabeads® KilobaseBINDER™试剂盒。KilobaseBINDER™试剂包括M-280链霉亲和素偶联的Dynabeads®磁珠和一种含有专利的固定活化剂的结合液,可结合较长的生物素化DNA分子以进行分离。请点击以下链接,查看关于长的生物素化DNA片段分离的更多信息。

DynaMag™磁力架

DynaMag™-2磁力架可容纳16个标准的1.5 mL或2 mL微量离心管,而DynaMag™-Spin磁力架最多能容纳6个标准的1.5 mL微量离心管。

使用以下任意一种清洁剂喷洗和/或擦拭DynaMag™磁力架:

  • 70%异丙醇
  • 1%次氯酸钠溶液(漂白剂)
  • 0.1 N HCl溶液

不要将装置浸泡在水溶液中,避免长时间接触于水或其他水溶液。不可将磁力架进行高压灭菌或加热至70°C以上。

1特斯拉等于10,000高斯。

DynaMag™-2磁力架的最低高斯值为3,500–3,700,DynaMag™-Spin磁力架最低高斯值为3,000–3,500。

链霉亲和素偶联的Dynabeads®磁珠

1 mg Dynabeads® M-280链霉亲和素磁珠通常可结合650–900 pmol游离生物素、200 pmol生物素化多肽、最多10 μg生物素化抗体、10 μg生物素化双链DNA或200 pmol生物素化单链寡核苷酸。

1 mg Dynabeads® M-270链霉亲和素磁珠通常可结合950 pmol以上游离生物素、200 pmol生物素化多肽、最多10 μg生物素化抗体、10 μg生物素化双链DNA或200 pmol生物素化单链寡核苷酸。

1 mg Dynabeads® MyOne™链霉亲和素C1磁珠通常可结合2,500 pmol以上游离生物素、400 pmol生物素化多肽、最多20 μg生物素化抗体、20 μg生物素化双链DNA或500 pmol生物素化单链寡核苷酸。

1 mg Dynabeads® MyOne™链霉亲和素T1磁珠通常可结合1,100–1,700 pmol游离生物素、400 pmol生物素化多肽、最多20 μg生物素化抗体、20 μg生物素化双链DNA或400 pmol生物素化单链寡核苷酸。

在直接捕获中,生物素化探针/配体先与Dynabeads®磁珠偶联,随后再加入样品。在间接捕获中,先将生物素化探针/配体加入到样品中,随后再加入Dynabeads®磁珠。直接捕获中预先偶联的配体使得Dynabeads®磁珠能够重复使用,而间接捕获在目标分子浓度较低、特异性亲和力较弱或结合动力学速度慢的情况下更有益。请点击以下链接,查看捕获图解。

所有生物素试剂都应包含一个间隔臂,至少为一个6-碳接头,以减少空间位阻。这是因为生物素的双环能够进入到链霉亲和素的生物素结合槽深处。一个6碳臂是在生物素和序列第一个碱基之间能够减少空间位阻所需的最短长度。该距离越长,空间位阻越小。6-碳接头是大多数公司采用的标准接头尺寸,应该能够满足大部分应用需求。我们推荐在探针的5’端进行特定的生物素化。

尚未检测过每个磁珠结合的链霉亲和素分子精确数量,但每毫克Dynabeads® M-280链霉亲和素磁珠大约结合14-16 µg链霉亲和素。

链霉亲和素是由4个相同亚基组成的蛋白质,每个亚基含有一个高亲和力生物素结合位点(KD = 10-15 M)。与亲和素相比,链霉亲和素具有相同的生物素结合特性,但非特异性结合较少。在固定到磁珠上之后,有2-3个结合位点可用于与生物素自由发生相互作用

我们的Dynabeads®链霉亲和素磁珠可直接用于PCR,但对单位体积磁珠的用量有所限制。对于Dynabeads® M-280链霉亲和素磁珠,每50 μL PCR反应使用多达50 μL磁珠,不会对酶反应产生任何抑制作用;50-100μL磁珠将对PCR产生一些抑制作用。对于Dynabeads® M-270链霉亲和素磁珠,每50 μL反应使用多达100 μL磁珠,不会对酶反应产生任何抑制作用。Dynabeads® MyOne™链霉亲和素磁珠的情况和M-270链霉亲和素磁珠相同。我们推荐重新测试用于特定PCR或实时PCR反应的磁珠量,因为测试中不同的盐条件可能产生不同的结果。

您可通过检测上清液中未结合的核酸量,从而得到与Dynabeads®链霉亲和素磁珠结合的核酸量。通过OD检测或凝胶电泳可获知核酸浓度。也可以对核酸进行放射性标记以直接在磁珠上检测核酸浓度,或通过荧光标记核酸而在上清液中检测浓度。

链霉亲和素-生物素相互作用是已知最强的蛋白与其他分子间非共价的生物相互作用。生物素与链霉亲和素间的键形成非常迅速,一旦形成,就不会受到pH、温度、有机溶剂和其他变性剂等多种极端因素的影响。从链霉亲和素上分离生物素时,如果实验中使用的是生物素的衍生物或经修饰的链霉亲和素,那么需要特定形式和通常温和的方法解离,除此之外通常情况下都需要非常剧烈的方法解离,并且会使链霉亲和素变性。下面探讨了其中两种方法。

生物素化核酸:为了从Dynabeads®链霉亲和素磁珠上分离生物素化核酸,在pH 8.2的95%甲酰胺+ 10 mM EDTA中孵育磁珠,65°C孵育5分钟或90°C孵育2分钟。使用磁力架将磁珠吸到试管壁上,将含有生物素化核酸的上清液从试管中取出。Holmberg等(Electrophoresis 26, 501-510, 2005)报道称,在用离子水短时间孵育后,可将生物素化DNA从链霉亲合素磁珠上释放(但是我们尚未对此进行测试)。

生物素化蛋白质:对于生物素化蛋白质,则可在0.1% SDS或SDS-PAGE缓冲液中煮沸磁珠3分钟。

选择哪种产品取决于样本的性质、使用的缓冲液和溶液以及下游应用。通常,所有Dynabeads®链霉亲和素磁珠都可用于生物素化配体相关的应用;然而,在特殊应用中,有些磁珠可能因其特性而比其他磁珠的效果更好。Dynabeads® M-280链霉亲和素磁珠和Dynabeads® MyOne™链霉亲和素T1磁珠常用于蛋白质和核酸相关应用。Dynabeads® M-270链霉亲和素磁珠和MyOne™链霉亲和素C1磁珠更适用于核酸诊断,特别是用于含有高浓度高离液盐的样本、涉及小的生物素化抗原的免疫分析以及与BSA不相容的应用,因为这些磁珠没有包被BSA。Dynabeads® MyOne™链霉亲和素磁珠具有更强的结合能力和更慢的沉降速度,使其适用于自动化应用以及需要分离大量生物素化化合物或其特异性靶标的情况。请点击这里查看选择指南。

由于具有空间位阻,因此结合能力取决于片段大小。例如,500 bp片段在Dynabeads® M-280链霉亲和素磁珠上的结合量是1,000 bp片段的2倍。长DNA片段会占据磁珠周围更多空间,使其更难“找到”磁珠上的链霉亲和素。较短的片段更易接近链霉亲和素。对于大于2kb的DNA片段,推荐使用Dynabeads® kilobaseBINDER™试剂盒。该试剂盒包括Dynabeads® M-280链霉亲和素磁珠和一种可增强长生物素化DNA片段(大于2kb)固定的结合液。对于大于1-2kb的DNA片段,推荐使用Dynabeads® kilobaseBINDER™试剂盒,因为结合液可增强结合能力。该结合液可使DNA线性化,进而伸展且碱基堆叠成刚性结构(不适用于质粒或环状核酸等较短的片段)。

盐浓度可影响生物素化核酸与Dynabeads®链霉亲和素磁珠的结合效率。对于1kb以内的生物素化DNA片段,最佳结合条件为1M NaCl(终浓度),25℃孵育15分钟;较长的DNA片段应固定过夜。生物素化抗体应在含0.1% BSA,pH 7.4的PBS缓冲液中固定。由于游离生物素与Dynabeads®链霉亲和素磁珠结合的速度比大分子更快,因此应确保您的样本不含过量的游离生物素。应使用反向HPLC或FPLC回收生物素化寡核苷酸,以避免样本中游离生物素的存在。由于待固定的特定分子的大小和生物素化过程都将影响磁珠的结合能力,因此,可采用滴定法优化每个单独应用中的磁珠使用量。

Dynabeads®链霉亲和素磁珠不是以无RNase溶液的形式提供的。处理RNA时,应使用DEPC处理的0.1 M NaOH/0.05 M NaCl溶液清洗磁珠2次,每次1-3分钟。DEPC毒性很强,但能去除RNase。清洗后,可使用DEPC处理的0.1 M NaCl溶液重悬磁珠。

“DEPC处理”是指:加入0.1% DEPC,混合,室温下孵育1小时。随后,将DEPC处理的溶液进行高压灭菌,以破坏DEPC。

可通过碱处理或高温处理分离DNA双链。采取碱处理时,可使用0.1 M NaOH洗脱非生物素化链。通常情况下,该处理方法不会对磁珠产生任何影响。

  • 在NaOH处理前,在2X结合和洗涤缓冲液(10 mM Tris-HCl,pH 7.5,1 mM EDTA,2 M NaCl)中清洗Dynabeads®/DNA复合物1次,除去上清液。高盐浓度将有助于减少电荷,从而使非特异性结合最小化。
  • 向Dynabeads®/DNA复合物中加入新鲜配制(很重要)的0.1 M NaOH溶液,室温下旋转孵育2-3分钟(最多5分钟)。除去含有非生物素化链的上清液。
  • 再用0.1 M NaOH溶液清洗Dynabeads®/DNA复合物1次,除去上清液。首次洗脱时,即可洗脱下大部分DNA。

除了碱处理,也可进行加热处理,在水中95°C加热5分钟即可。

为防止再退火,碱处理或高温处理后必须快速从磁珠上分离DNA,最好在冰上操作。加热会在一定程度(在水中约为7%)上引起生物素化DNA从链霉亲和素上解离。因此,我们通常更推荐采用碱处理法。

RNA捕获

mRNA分离是基于带poly(A+)尾的RNA (mRNA)与磁珠上共价偶联的Oligo(dT)25杂交而进行的。mRNA分离试剂盒中的结合缓冲液和裂解/结合缓冲液就是专为这种杂交而优化的。


我们提供多种用于mRNA分离的Dynabeads®产品,这些产品都基于Dynabeads® Oligo(dT)25磁珠。其分离原理是磁珠上共价偶联的Oligo(dT)25序列与真核生物mRNA的poly(A)尾之间的A:T碱基配对。产品如下:

  • Dynabeads® mRNA纯化试剂盒(货号:61006),用于从总RNA中分离mRNA。除了Dynabeads® Oligo(dT)25磁珠,该试剂盒还包括结合缓冲液、洗涤缓冲液和10 mM Tris-HCl。
  • Dynabeads® mRNA DIRECT™试剂盒(货号:61011和61012),用于从动物组织、植物组织和细胞粗提物中直接分离mRNA。除了Dynabeads® Oligo(dT)25磁珠,该试剂盒还包括裂解/结合缓冲液、洗涤缓冲液、10 mM Tris-HCl、再生溶液和储存缓冲液。
  • Dynabeads® mRNA DIRECT™ 微量试剂盒(货号:61021),用于从小样本中分离mRNA。除了Dynabeads® Oligo(dT)25磁珠,该试剂盒还包括裂解/结合缓冲液、洗涤缓冲液和10 mM Tris-HCl。

选择Dynabeads® mRNA DIRECT™试剂盒还是Dynabeads® mRNA DIRECT™微量试剂盒,取决于样本大小。微量试剂盒专门从小样本(例如,<4 mg的植物组织、<2 mg的动物组织、<150,000的细胞)中分离mRNA,且已被用于从少至单个细胞的微量材料中分离mRNA。Dynabeads® mRNA DIRECT™试剂盒可用于多达200–400 mg组织/20 x 10^6个细胞的样本。实验方案可成比例放大或缩小,以满足您的特定需求。

可以,Dynabeads® Oligo(dT)25磁珠可以重复使用。请查看以下推荐条件:

重复用于相同样品:
洗脱mRNA后,使用裂解/结合缓冲液(300 μL)清洗磁珠(原始体积200 μL)1次。随后,将磁珠重新加入到样本中,进一步分离mRNA。可重复多次分离步骤,直到样本中所有mRNA均被捕获。

重复用于不同样品:
为避免样品间mRNA的残留,应通过标准磁性分离步骤使用200μL再生溶液清洗磁珠3次。其中第一次清洗时,在65°C孵育2分钟。随后,使用200μL储存缓冲液Oligo(dT)25清洗,并持续清洗至pH低于8.0。将磁珠用适量储存缓冲液Oligo(dT)25重悬。此时,磁珠已被再生,可用于后续mRNA分离。将磁珠保存于2-8°C。不可将再生的磁珠与原始磁珠储液混合。

Dynabeads®磁珠可与TaqMan®实时PCR反应和非毛细管实时PCR仪器兼容。但是,Dynabeads®磁珠具有低水平的自发荧光,在一定程度上会增强PCR反应的荧光信号强度。这可通过在仪器中设置Dynabeads®磁珠和水的背景而进行补偿。随后,在所有包含Dynabeads®磁珠的实时PCR实验中,可从样本信号强度中减去背景信号强度。或者,在使用标准曲线法分析时,可在用于构建标准曲线的每个样本中均加入适量Dynabeads®磁珠。

原核生物mRNA通常不含poly(A+)尾,也就是说Dynabeads® Oligo(dT)25磁珠不可直接用于这种分离。但是,下述文章描述对细菌多聚核糖体(翻译过程中mRNA、核糖体和增长的肽链的聚集体)进行多聚腺苷酸化的方法,这种多核糖体随后即可使用Dynabeads® Oligo(dT)25进行分离:Amara RR et al., Nucleic Acids Research 25 (17), 3465–3470 (1997)

还可以使用具有生物素化探针的Dynabeads®链霉亲和素磁珠来特异性的捕获待分离的RNA。

每毫克磁珠的结合能力为2 μg。

在进行mRNA分离操作时,质粒会被去除。但是,如果一个polyA尾被克隆到质粒中,它将与Oligo(dT)25磁珠杂交,导致质粒被同时分离。

从结合在Dynabeads®磁珠上的mRNA生成全长cDNA是可能的。我们推荐使用一款热稳定的逆转录试剂盒,以便包含高GC二级结构的困难区域也可以被逆转录。但是,不能通过加热磁珠上的mRNA来启动反应,否则会导致mRNA的洗脱(A:T碱基对的热稳定性最差)。


我们内部尝试过使用ThermoScript™逆转录酶,并以磁珠上的oligo(dT)25为引物,按照厂家说明书进行cDNA合成。当使用热稳定逆转录酶和oligo(dT)25引物进行第一链cDNA合成时,在执行推荐的高温前,有必要先在50°C孵育5分钟。这是为了启动跨越A:T杂交点的cDNA合成,从而使mRNA不会脱离磁珠。所得的cDNA共价结合到磁珠表面,结合有cDNA的磁珠可被用作多种杂交反应的模板。

可以从同一样本中分离出基因组DNA和mRNA,但是,我们推荐首先使用Dynabeads® DNA DIRECT™通用试剂盒分离DNA,以避免较大的DNA片段在mRNA分离过程中结合到磁珠上。

分离出基因组DNA后,您可使用Dynabeads® mRNA DIRECT™试剂盒或Dynabeads® mRNA DIRECT™微量试剂盒从同一的裂解液中分离mRNA(只需在裂解液中加入Dynabeads® Oligo (dT)25磁珠,不要使用试剂盒中的裂解/结合缓冲液,按说明书进行后续操作)。

我们推荐立即将Dynabeads®磁珠-mRNA复合物或洗脱的mRNA用于RT-PCR的cDNA合成或其他下游应用。如果需要保存,我们推荐使用10 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)从磁珠上洗脱mRNA并冷冻保存(-80°C)。所有设备和样本都必须是无RNase的。

不需要,Dynabeads Oligo(dT)25磁珠可直接用于PCR反应。但是,建议每50 μL总PCR反应体系使用不超过100 μg Dynabeads® Oligo (dT)25磁珠。

Dynabeads® DNA DIRECT™试剂盒

得率取决于样本中有核细胞的数量。1单位(200 µL)Dynabeads® DNA DIRECT™通用试剂盒可从每个样本中分离至少200 ng高质量、可立即用于PCR的基因组DNA,可供10次PCR反应使用。应调整样本大小至与Dynabeads®磁珠的结合能力匹配。常规的起始样本为10,000个培养细胞或10 µL血液。可调整实验方案,以应用于30 µL血液样本,供30-50次下游PCR扩增(600 ng至1 µg DNA)使用。

在裂解和洗涤步骤中,分离的DNA可以维持染色体长度。在此期间,应小心不要破坏DNA/Dynabeads®复合物。重悬时的剪切力度决定了最终片段的平均长度。正常情况下,平均片段长度超过20kb。PCR结果显示出卓越的可重复性和高度灵敏性。

Dynabeads® DNA DIRECT™磁珠不可重复使用。从磁珠上除去所有DNA残留是绝对不可能的。与使用过的试管和移液枪头一样,磁珠上残留的的DNA会对之后任何样本的下游PCR造成污染。

使用弱碱性的低离子强度的buffer,并加热(55至90°C)。

不一定。如果您想要分离完整的核小体(组蛋白+DNA复合物),则不能使用Dynabeads® SILANE磁珠。但是,如果DNA和核小体是非交联的,则可使用该磁珠从核小体中分离DNA。对于染色质免疫沉淀,可考虑使用MAGnify™染色质免疫沉淀系统。

Dynabeads® SILANE病毒核酸试剂盒可结合基因组DNA和病毒核酸。但是,该缓冲液已经过优化,对较短片段和非常少量的病毒DNA/RNA的结合能力更强。不建议将该缓冲液用于基因组DNA的结合,因为基因组DNA与磁珠表面的相互作用会更强,导致洗脱基因组DNA比洗脱病毒核酸更难操作。

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仅限研究用途,不可用于诊断操作。