Die digitale PCR stellt einen neuen Ansatz für den Nukleinsäurenachweis und die Quantifizierung dar und bietet damit eine alternative Methode zur herkömmlichen quantitativen Echtzeit-PCR für die absolute Quantifizierung und den Nachweis von seltenen Allelen. Die digitale PCR erfolgt durch Trennung einer DNA- oder cDNA-Probe in viele einzelne, parallele PCR-Reaktionen, von denen einige das Zielmolekül enthalten (positiv) und andere nicht (negativ). Ein einzelnes Molekül kann millionenfach oder mehr amplifiziert werden. Bei der Amplifikation wird die TaqMan® Chemie mit durch Farbstoff markierten Sonden zur Detektion von sequenzspezifischen Zielen verwendet. Wenn keine Zielsequenz vorliegt, wird kein Signal akkumuliert. Im Anschluss an die PCR-Analyse wird anhand der Fraktion der negativen Reaktionen die absolute Anzahl der Zielmoleküle in der Probe bestimmt, ohne dass dafür Standards oder endogene Kontrollen erforderlich sind.
Die Verwendung eines nanofluidischen Chips bietet einen praktischen und unkomplizierten Mechanismus für die parallele Ausführung tausender von PCR-Reaktionen. Jedes Well wird mit einer Mischung aus Probe, Master Mix und TaqMan® Assay-Reagenzien beschickt und einzeln analysiert, um das Vorhandensein (positiv) oder Fehlen (negativ) eines Endpunktsignals zu ermitteln. Um zu berücksichtigen, dass manche Wells mehr als ein Molekül der Zielsequenz erhalten haben können, wird entsprechend des Poisson-Modells ein Korrekturfaktor angewendet.
Instrumente und Reagenzien der digitalen PCR verbessern die Leistung bestehender TaqMan® Assays und ermöglichen so Anwendungen, die von einer höheren Sensitivität und Präzision sowie von absoluter Quantifizierung profitieren.
