El kit de «pull-down» y detección de Rac1 activo Thermo Scientific es un kit completo para el enriquecimiento selectivo y la detección de Rac1 GTPasa unida a GTP a través de una interacción específica de proteínas con el dominio de unión de proteínas de Pak1.

El kit de «pull-down» y detección de Rac1 activo incluye dominio de unión de proteínas (PBD) GST-Pak1 purificado, resina de glutatión agarosa, controles positivos y negativos (GTPγS y GDP, respectivamente), tampón de lisis/unión/lavado, anticuerpo primario anti-Rac1, tampón de muestra SDS, columnas de centrifugado y tubos de recogida. El kit fue validado usando lisados de células NIH3T3, una línea celular que es conocida por tener una fuerte actividad Rac1.

Características del kit de detección y «pull-down» de Rac1 activo:

• Gran sensibilidad y precisión: los reactivos optimizados, el anticuerpo anti-Rac1 específico y el procedimiento Western blot garantizan unos controles precisos y resultados semicuantitativos
• Validado: funcionalmente probado para la detección de Rac1 para garantizar la calidad y el rendimiento
• Compatible: eficaz con una variedad de tipos de células de ratón, rata y fuentes humanas

Aplicaciones:
• Seguimiento de la activación de Rac1 GTPasa durante la diferenciación celular, la migración, la división y la reordenación citoesquelética
• Estudio de la formación lamelipolia dependiente de Rac1
• Estudio de la función del Rac1 activo en el cáncer y angiogénesis
• Supervisión de la actividad de Rac1 después de la estimulación con factores de crecimiento
• Cribaje de los inhibidores de moléculas pequeñas para ver sus efectos en la actividad de Rac1

El kit activo de «pull-down» y detección de Rac1 se validó para la función y especificidad del método de enriquecimiento Ras activo utilizando lisados celulares tratados con GTPγS para activar el Rac1 endógeno y se comparó con lisados tratados con GDP para inactivar la pequeña GTPasa. El tratamiento con GTPγS atrapa Rac1 en la forma activa ligada al GTP, dando como resultado una señal fuerte cuando está presente el Rac1 endógeno. El tratamiento del GDP empuja a Rac1 a un estado de unión inactivo al GDP, dando como resultado una señal mínima o nula, independientemente de los niveles de proteína Rac1. El kit está optimizado para la detección de Western blot con un anticuerpo secundario conjugado con HRP (IgG de cabra antirratón, n.° de pieza 31430) y el sustrato quimioluminiscente Thermo Scientific SuperSignal West Pico (n.° de pieza 34080). El kit contiene suficientes componentes para 30 ensayos de «pull-down».

Fondo de Rac1:
La familia GTPasa de Rho tienen muchas funciones celulares, incluyendo la señalización celular, regulación transcripcional y organización del citoesqueleto de actina. Esta familia de GTPasa comprende Rho (RhoA, RhoB y RhoC), Rac (Rac1, Rac2, Rac3 y RhoG), Cdc42 (Cdc42 y G25K), Rnd (Rnd1, Rnd2 y RhoE/Rnd3), RhoBTB y la familia Miro. Estas GTPasa permiten la transducción de señales desde la membrana plasmática al citosol a través de GPCR, tirosina cinasa, citoquinas y receptores de adhesión. La adhesión a la membrana plasmática se logra a través de las modificaciones de lípidos de geranilgeranil en el terminal carboxílico de la proteína. La activación de Rac1 da como resultado la polimerización de la actina y aparece como un rizado de la membrana en la periferia celular. La activación de Rac1 también da lugar a la formación de lamelipodia.

La Rac1 GTPasa transduce señales a través de tirosina cinasas, moléculas de adhesión o receptores de citoquinas/quimiocina después de la estimulación con factores de crecimiento (EGF, insulina, PDGF, NGF), integrinas (fibronectina) o quimioatrayentes (fMLP). Por ejemplo, la estimulación con EGF da como resultado la activación de la PI3 cinasa, lo que resulta en el crecimiento celular y la reorganización en la periferia celular (rizado de membrana). Alternativamente, la señalización de la tirosina cinasa del receptor a través de Rac1 conduce a la activación de las vías de respuesta al estrés SAPK de MAPK (JNK) y p38. La estimulación de las células con fibronectina provoca la propagación celular mediada por la integrina. Dos de las principales proteínas efectoras de Rac1 son Pak1 y fosfoinositol 4-fosfato 5-cinasa. Pak1 (p65 Pak) es una cinasa que activa la vía JNK, mientras que el fosfoinositol 4-fosfato 5-cinasa promueve el ensamblaje de filamentos de actina. El Rac es fundamental para el desarrollo de células T y para promover la diferenciación de células. Sin embargo, la familia Rho de GTPasas puede funcionar agonísticamente durante la señalización celular y antagonísticamente durante la diferenciación.

Más datos del producto
• Medir la activación de pequeñas GTPasas a través de sus efectores posteriores específicos
• Detección y localización de GTPasas activas en la diferenciación celular neuronal