LightShift™ Chemiluminescent RNA EMSA Kit

Le kit EMSA d’ARN chimiluminescent LightShift Thermo Scientific fournit une solution non radioactive pour l’étude des interactions ARN-protéines à l’aide d’une analyse de mobilité électrophorétique (EMSA).

Caractéristiques du kit EMSA d’ARN chimiluminescent LightShift :

• Sensible : détection par chimiluminescence sensible comparable à la détection radioactive
• Gain de temps : développer des films radiographiques après des expositions de 1 à 5 minutes, contre 16 heures d’exposition nécessaires avec des systèmes radioactifs
• Flexible : compatible avec les sondes d’ARN biotinylées par différentes méthodes
• Prêt à l’emploi : le kit complet comprend des réactifs optimisés pour les réactions de liaison et détection de sondes d’ARN
• Non-radioactif : élimine les problèmes liés aux déchets des sondes d’ARN radioactives

Le kit d’ARN EMSA utilise des sondes d’ARN biotinylées et un système de substrat chimiluminescent pour obtenir une détection rapide et sûre des complexes ARN-protéines avec une sensibilité équivalente aux méthodes traditionnelles ³²P-isotopiques. Le kit complet est fourni avec tous les réactifs nécessaires à la mise en place et à l’optimisation des conditions de liaison protéine-ARN, un contrôle positif des interactions protéine-ARN et des réactifs pour la détection chimiluminescente de l’interaction acide nucléique.

À propos du kit EMSA d’ARN chimiluminescent LightShift
Le kit EMSA d’ARN chimiluminescent LightShift est une technique in vitro pour la détection des interactions protéine-ARN par des changements dans les modèles de migration d’électrophorèse sur gel similaires au test populaire de déplacement sur gel d’ADN. Dans une EMSA d’ARN, une sonde ARN marquée est incubée avec un échantillon de protéines pour initier la liaison. Une fois qu’un complexe est formé, l’échantillon est séparé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide non dénaturant. Comme les complexes ARN-protéines migrent plus lentement que les sondes d’ARN libres, la différence de distance de migration qui en résulte peut être visualisée à l’aide du test de retard sur gel de l’ARN. La spécificité des interactions ARN-protéine est validée par la concurrence de liaison avec l’ARN non marqué en excès qui diminue le signal des interactions spécifiques. En général, les sondes d’ARN mutées ou non pertinentes ne devraient pas être compétitives pour des interactions spécifiques et ne devraient pas réduire l’intensité des décalages de bandes spécifiques lorsqu’elles sont détectées dans l’EMSA. Le kit EMSA ARN chimiluminescent LightShift complet comprend tous les réactifs nécessaires à la mise en place et à l’optimisation d’un retard sur gel d’ARN, y compris un contrôle positif pour la formation de complexes ARN-protéines.

Le kit EMSA ARN chimiluminescent LightShift utilise des sondes d’ARN biotinylées, streptavidine-HRP et une détection chimiluminescente pour fournir une sensibilité similaire à l’utilisation de sondes d’ARN radioactives mais avec une détection plus rapide. Les sondes d’ARN marquées peuvent être achetées dans le commerce ou générées par des réactions de transcription in vitro avec des nucléotides biotinylés ou par ligature enzymatique des marqueurs de biotine au niveau de l’extrémité 3’ d’un brin d’ARN à l’aide du kit de biotinylation de l’extrémité 3’ de l’ARN de Pierce Thermo Scientific. Le kit EMSA d’ARN chimiluminescent LightShift est efficace pour les sondes d’ARN biotinylées par l’une de ces trois méthodes ; cependant, la structure secondaire de l’ARN peut être affectée par l’incorporation interne de nucléotides biotinylés lors de la synthèse de sondes d’ARN de transcription in vitro. Par conséquent, pour certaines interactions, des sondes d’ARN synthétisées sur mesure ou des sondes biotinylées à l’extrémité 3’ peuvent être nécessaires pour que les interactions protéine-ARN se produisent correctement.

À propos du contrôle positif du kit EMSA ARN chimiluminescent LightShift Contrôle positif
Le contrôle positif inclus dans le kit EMSA ARN chimiluminescent LightShift est la sonde d’ARN d’élément réactif au fer (IRE). Les réactions de liaison des IRE sont mises en place et détectées en parallèle des autres échantillons expérimentaux. Dans des conditions pauvres en fer, la protéine réactive au fer (IRP) reste liée à l’ARN de l’IRE présent dans la cellule, supprimant efficacement la traduction de la ferritine (une protéine de stockage du fer) puis du récepteur de fer de la transferrine. Dans des conditions riches en fer, l’activité de liaison des IRE est perdue, entraînant la traduction de la ferrite et de la transferrine. Ce système est très répandu et produit un décalage de bande robuste. L’incubation de la réaction de contrôle positif avec un excès molaire de 200 fois de l’ARN de l’IRE non marqué réduira le signal de décalage spécifique des bandes de l’IRE d’environ 70 % ; en revanche, un excès similaire d’une sonde d’ARN non apparentée ne permettra pas de réduire de manière significative le décalage des bandes de l’IRE. Ces contrôles peuvent être utilisés dans chaque expérience de retard sur gel de l’ARN pour la validation de la configuration, de l’électrophorèse, du transfert et de la détection de la formation de complexes ARN-protéines adéquats.

Produits connexes
ARNt pour le kit EMSA ARN chimiluminescent LightShift™