DTNB (réactif d’Ellman) (5,5-dithio-bis-(acide 2-nitrobenzoïque)

Le réactif d’Ellman Thermo Scientific Pierce (DTNB) réagit avec les groupes sulfhydryle pour produire un produit coloré, qui fournit une méthode fiable pour mesurer les cystéines réduites et d’autres sulfhydryles libres en solution.

Le réactif d’Ellman (5,5’-dithio-bis-[acide 2-nitrobenzoïque]) est utilisé pour estimer les groupes sulfhydryle dans un échantillon en le comparant à une courbe étalon d’un composé contenant des sulfhydryles tels que la cystéine. Les groupes sulfhydryle peuvent également être dosés à l’aide du coefficient d’extinction du TNB (14,150 M-1 cm-1 à 412 nm). Le réactif d’Ellman a été utilisé pour des applications autres que l’estimation de sulfhydryle, telles que la détermination des alkylthiols par HPLC à l’aide d’une procédure de dérivatisation précolonne et l’étude des thiols sur le site actif de plusieurs enzymes.

Caractéristiques du réactif d’Ellman :

• Dosage sulfhydryle : réagit quantitativement avec les groupes sulfhydryle (—SH) libres (réduits) pour donner un produit TNB détectable
• Détection colorimétrique : le produit coloré permet une mesure spectrophotométrique dans les cuvettes ou les microplaques (λmax = 412 nm ; ε = 14,150 / M·cm)
• Méthode éprouvée : une chimie bien caractérisée permet de quantifier les groupes sulfhydryle des peptides ou des protéines par le calcul du coefficient d’extinction ou par comparaison avec un étalon de cystéine

Propriétés du réactif
• Autres dénominations : DTNB, réactif d’Ellman
• Nom chimique : 5,5’-dithio-bis-(acide 2-nitrobenzoïque)
• Réactif envers : Groupes sulfhydryles (—SH)
• Formule chimique : C₁₄H₈N₂O₈S₂
• Numéro CAS : 69-78-3
• Poids moléculaire : 396,35
• Forme : Poudre cristalline jaune

Le DTNB réagit avec un groupe sulfhydryle libre pour donner un mélange de disulfure et d’acide 2-nitro-5-thiobenzoïque (TNB). La cible du DTNB dans cette réaction est la base conjuguée (R—S-) d’un groupe sulfhydryle libre. Par conséquent, la vitesse de cette réaction dépend de plusieurs facteurs : (1) le pH de la réaction, (2) le pKa’ du sulfhydryle et (3) les effets stériques et électrostatiques. Le TNB est l’espèce colorée produite dans cette réaction et possède un coefficient d’extinction molaire élevé dans le domaine visible. Le coefficient d’extinction molaire du TNB a été initialement rapporté par Ellman (1959) comme étant de 13,600 M-1 cm-1 à 412 nm et à un pH de 8,0. Par conséquent, cette valeur a été fréquemment citée dans la littérature. Des études ultérieures ont toutefois montré que le coefficient d’extinction molaire est plus précisément reflété par une valeur de 14,150 M-1 cm-1 à 412 nm. L’extinction du TNB n’est pas affectée par les variations de pH entre 7,6 et 8,6. Cependant, l’extinction de TNB est différente dans d’autres solvants.