TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kit

Le kit Ambion™ TaqMan PreAmp Cells-to-C_T permet l’analyse de l’expression génétique directement à partir d’un nombre limité ou restreint de cellules cultivées sans purification d’ARN. Le protocole comprend une étape d’amplification intermédiaire (pré-amplification) entre la transcription inverse et la PCR en temps réel dans laquelle l’ADNc est enrichi pour jusqu’à 100 cibles génétiques du choix de l’utilisateur sans biais d’amplification.

• Solution complète validée—Flux de travail optimisé qui comprend les réactifs de lyse cellulaire, la DNase, les réactifs RT, les réactifs PreAmp et le mélange d’expression génétique TaqMan™ Gene Expression Master Mix
• Rapide, simple et pratique—Préparez les échantillons en 7 minutes ; éliminez l’étape fastidieuse d’isolement de l’ARN
• Étendre les échantillons limités—Augmentez le potentiel de la PCR en temps réel jusqu’à 64 fois ; étudiez jusqu’à 100 gènes à la fois
• Résultats précis—Amplification uniforme sans introduction de biais
• Performances fiables—Détection linéaire de 10 à 100 000 cellules ; résultats équivalents à l’ARN purifié

Solution complète validée

Basé sur une méthode unique de lyse des cellules de culture et d’élimination de l’ADN génomique et de préservation de l’intégrité de l’ARN, le kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ contient les réactifs de transcription inverse (RT) pour la synthèse d’ADNc, le mélange TaqMan™ PreAmp Master Mix pour la pré-amplification de jusqu’à 100 cibles génétiques et le Master Mix d’expression génétique TaqMan™ pour l’analyse PCR en temps réel.

Préparation des échantillons simple et pratique en 7 minutes

Le kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ intègre une procédure de préparation des échantillons simple en 7 minutes (figure 1) pour une utilisation avec des échantillons de 10 à 100 000 cellules de culture⁄. Les cellules sont nettoyées dans du PBS et lysées en solution pendant 5 minutes à température ambiante ; le traitement par DNase peut être réalisé simultanément. La lyse est terminée à température ambiante par une incubation de 2 minutes avec une solution d’arrêt.

Les lysats sont désormais prêts pour la transcription inverse ou une conservation à –20°C. Étant donné que les échantillons peuvent être traités directement dans des puits de culture (96 ou 384 puits), la manipulation des échantillons et le risque de perte des échantillons ou d’erreur de transfert sont minimisés, ce qui facilite l’extension des échantillons limités. Aucune étape de chauffage, nettoyage ou centrifugation n’est nécessaire ; le kit simplifie considérablement un processus typiquement chronophage et laborieux et le réduit à 7 minutes.

Extension d’échantillons limités—Augmentez le potentiel de la PCR en temps réel jusqu’à 64 fois

L’intégration de la technologie Cells-to-C_T™ avec une capacité de pré-amplification rationalise un flux de travail en plusieurs étapes tout en étendant considérablement (plus de 60 fois) le nombre de réactions de PCR possibles à partir d’échantillons précieux et augmente la sensibilité de la détection d’ARNm à partir de petites quantités d’entrée d’échantillon.

La réaction de PCR en temps réel standard pour l’analyse de l’expression génétique commence par la transcription inverse de l’ARN total à l’ADNc à l’aide d’amorces aléatoires et d’oligo dT, suivie d’une PCR en temps réel à l’aide de sondes et d’amorces spécifiques aux gènes (figure 2). Avec le kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™, une étape d’amplification intermédiaire (pré-amplification) entre la transcription inverse et la PCR en temps réel est réalisée dans laquelle l’ADNc est enrichi pour jusqu’à 100 cibles génétiques du choix de l’utilisateur sans biais d’amplification. La réaction pré-amplifiée qui en résulte est diluée et sert de matériau de départ pour les dosages individuels d’expression génétique TaqMan™ suivants à l’aide du mélange d’expression génétique TaqMan™ Gene Expression Master Mix inclus dans le kit. Le processus TaqMan™ PreAmp étend efficacement les échantillons jusqu’à 64 fois, ce qui permet des analyses précédemment impossibles à partir de matériaux d’échantillons limités.

Résultats précis—Amplification égale sans introduction de biais

La capacité de réaliser une pré-amplification fiable et uniforme est essentielle pour l’analyse de l’expression génétique à partir d’échantillons limités. Bien que d’autres méthodes soient disponibles pour pré-amplifier l’ARN ou l’ADNc, elles utilisent un amorçage non spécifique pour amplifier le produit de départ, ce qui entraîne une amplification biaisée et inexacte de certains transcrits par rapport à d’autres. Le Master Mix TaqMan™ PreAmp, qui fait partie du kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™, utilise des amorces spécifiques aux gènes pour pré-amplifier l’ADNc, ce qui entraîne une amplification non biaisée. Le kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ démontre une pré-amplification non biaisée équivalente à l’ARN purifié lorsqu’il est comparé à 100 dosages d’expressions génétiques TaqMan différents. Comme l’illustre la figure 3, la réaction de pré-amplification n’introduit pas de biais à partir des lysats Cells-to-C_T™ ni d’échantillons purifiés. ≥ 92 % des dosages étaient de +⁄- 1,5 ΔΔ CT pour l’ADNc pré-amplifié ou non amplifié provenant d’ARN purifié (A) ou des lysats du kit Cells-to-C_T™ (B).

Performances robustes : résultats équivalents à ceux de l’ARN purifié
Les performances du kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ ont été évaluées avec 100 dosages TaqMan™ différents utilisant des lysats Cells-to-C_T™ ou de l’ARN purifié, avec ou sans que pré-amplification. Comme le montre la figure 4, les valeurs CT obtenues avec les lysats du kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ étaient équivalentes et souvent supérieures aux valeurs CT obtenues à l’aide d’ARN purifié, avant (A) ou après pré-amplification (B). Le haut niveau de performance des lysats du kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ peut être attribué à la conservation de l’ARN dans les échantillons de départ sans perte de chauffage, de transfert ou d’adsorption dans les matrices.

Détection linéaire de 10 à 100 000 cellules

Chaque étape d’un flux de travail pour le profilage de l’ARN doit être robuste pour fonctionner à partir de quelques ou plusieurs cellules. Le kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ a été optimisé pour assurer, de manière efficace, une linéarité sur 5 logs d’entrée cellulaire avec 10 à 100 000 cellules par réaction de lyse (Figure 5). Par ailleurs, le kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ permet, afin de maximiser la sensibilité, que 45 % du volume de réaction RT soit composé de lysats d’échantillons. Le kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ fournit une sensibilité maximale dérivée du grand volume de lysat utilisé dans la réaction RT, des conditions de réaction RT optimisées et la pré-amplification des échantillons avant la PCR en temps réel.

Performances éprouvées ensemble

Tous les composants du kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ ont été optimisés pour offrir des performances constantes et fiables. Cela permet d’éliminer toute conjecture liée à l’assemblage des différentes préparations des échantillons, de la RT, de la pré-amplification et des kits de PCR en temps réel. Pour une meilleure assurance de la qualité, le kit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ a été validé avec les dosages d’expression génétique TaqMan™.