TaqMan™ MicroRNA Cells-to-C_T™ Kit

Le kit Ambion™ TaqMan™ MicroRNA Cells-to-C_T™ permet le profilage d’expression micro-ARN (miARN) directement à partir de cellules de culture sans purification de l’ARN. Ce kit est le premier à offrir un flux de travail simple et complet pour l’analyse d’expression du miARN à partir de quelques échantillons, ou il peut facilement être incorporé dans des applications automatisées à haut débit.

• Solution complète validée : flux de travail optimisé qui comprend les réactifs de lyse cellulaire, la DNase, les réactifs RT TaqMan™ Micro-ARN et le Master Mix PCR universel TaqMan™
• Rapide, simple et pratique : préparez les échantillons en 10 minutes ; éliminez l’étape fastidieuse d’isolement de l’ARN
• Spécificité de l’étalon or : obtenez des résultats supérieurs grâce aux réactifs TaqMan™ Micro-ARN
• Performances fiables : résultats équivalents à l’ARN purifié
• Large plage dynamique de matériaux d’entrée—Détection linéaire allant de 10 à 100 000 cellules

Solution complète validée

Basé sur une méthode unique de lyse des cellules de culture et d’élimination de l’ADN génomique et de préservation de l’intégrité de l’ARN, le kit TaqMan™ MicroRNA Cells-to-C_T™ contient des réactifs de transcription inverse (RT) TaqMan™ Micro-ARN et le mélange TaqMan™ Universal PCR Master Mix pour analyse PCR en temps réel. Le kit TaqMan™ MicroRNA Cells-to-C_T™ a été testé en profondeur et validé avec les dosages TaqMan™ Micro-ARN, vendus séparément.

Préparation des échantillons simple et pratique en 10 minutes

Le kit TaqMan™ MicroRNA Cells-to-C_T™ intègre une procédure de préparation des échantillons simple en 10 minutes (figure 1) pour une utilisation avec des échantillons de 10 à 100 000 cellules de culture ⁄, dans des plaques ou des tubes. Les cellules sont nettoyéeses dans du PBS et lysées en solution pendant 8 minutes à température ambiante ; le traitement par DNase peut être réalisé simultanément. La lyse est terminée à température ambiante par une incubation de 2 minutes avec une solution d’arrêt.

Les lysats du kit TaqMan™ MicroRNA Cells-to-C_T™ sont désormais prêts pour la transcription inverse ou une conservation à -20 °C pendant 5 mois maximum. Comme les échantillons ne sont pas soumis à un processus de purification d’ARN, toutes les petites espèces d’ARN sont disponibles pour analyse. Étant donné que les échantillons peuvent être traités directement dans des plaques de culture (96 ou 384 puits), la manipulation des échantillons et le risque de perte des échantillons ou d’erreur de transfert sont minimisés. Aucune étape de chauffage, lavage ou centrifugation n’est nécessaire ; le kit simplifie considérablement un processus typiquement chronophage et laborieux et le réduit à 10 minutes.

Spécificité de l’étalon or—Résultats supérieurs grâce aux réactifs TaqMan™ Micro-ARN

Applied Biosystems a développé une solution de pointe au problème fondamental associé à la courte longueur des miARN matures. Les dosages TaqMan™ Micro-ARN (vendus séparément) comprennent une amorce de transcription inverse de la structure tige-boucle unique et spécifique à la cible (figure 2). La structure tige-boucle est conçue pour incorporer la spécificité du miARN mature ciblé, contrairement à d’autres méthodes qui étendent et amorcent sans distinction tous les ARN d’un échantillon. Les réactifs RT TaqMan™ Micro-ARN, inclus dans le kit TaqMan™ MicroRNA Cells-to-C_T™ ont été spécifiquement conçus pour fonctionner en conjonction avec cette conception innovante de dosage.

La capacité à distinguer les cibles de micro-ARN matures hautement homologues est requise pour une analyse précise de l’expression du micro-ARN. Le kit TaqMan™ MicroRNA Cells-to-C_T™, en association avec les dosages TaqMan™ Micro-ARN, offre la spécificité nécessaire pour distinguer les cibles hautement homologues, comme le montre la figure 3. Dans cet exemple, des lysats du kit TaqMan™ MicroRNA Cells-to-C_T™ ou de micro-ARN purifié ont été utilisés lors de l’analyse PCR en temps réel à l’aide des dosages TaqMan™ MicroARN pour détecter des différences de base uniques sur des modèles de micro-ARN ajoutés de manière exogène. La spécificité obtenue avec les lysats du kit pour micro-ARN TaqMan™ Cells-to-C_T™ (figure 3A) est équivalente à celle obtenue à l’aide d’ARN purifié (figure 3B).

Performances robustes—Résultats équivalents à ceux de l’ARN purifié

Ce nouveau kit a été largement testé avec une gamme étendue de puces à ADN pour micro-ARN TaqMan™ et affiche des performances équivalentes à celles obtenues avec l’ARN purifié (figure 4). Le flux de travail du kit pour micro-ARN TaqMan™ Cells-to-C_T™ permet de procéder à une évaluation inégalée de l’expression du micro-ARN > 900 dosages de micro-ARN TaqMan™ disponibles.

Large plage dynamique de matériaux d’entrée : détection linéaire de 10 à 100 000 cellules

Étant donné que les niveaux d’expression du micro-ARN peuvent grandement varier en raison du type d’échantillons, du stade de développement ou de la progression de la maladie, il est important d’utiliser des outils analytiques sensibles de l’expression du micro-ARN. Désormais, les cibles du micro-ARN qui varient de quelques copies à des millions de copies peuvent être précisément quantifiées dans la même expérience.

Le kit pour micro-ARN TaqMan™ Cells-to-C_T™ fonctionne de façon robuste avec un nombre de cellules allant de 10 à 100 000. Par ailleurs, le kit pour micro-ARN TaqMan™ Cells-to-C_T™ permet, afin de maximiser la sensibilité, que 33 % du volume de réaction RT soit composé de lysats d’échantillons (RT uniplexe). La figure 5 illustre la linéarité et la sensibilité de la détection depuis les lysats du kit pour micro-ARN TaqMan™ Cells-to-C_T™ sur 5 logs d’entrée cellulaire par réaction de lyse ; avec des résultats équivalents à ceux de l’ARN purifié. En outre, la plage dynamique étendue des puces à ADN pour micro-ARN TaqMan™ n’est pas compromise par les lysats du kit pour micro-ARN TaqMan™ Cells-to-C_T™ (données non affichées).

Performances éprouvées, ensemble

Tous les composants du kit pour micro-ARN TaqMan™ Cells-to-C_T™ ont été optimisés pour garantir des performances régulières et fiables. Cela permet d’éliminer toute conjecture liée à l’assemblage de kits séparés pour différentes préparations d’échantillons, transcription inverse et la PCR en temps réel. Le kit pour micro-ARN TaqMan™ Cells-to-C_T™ a été validé avec les dosages pour micro-ARN TaqMan™ afin d’assurer une meilleure assurance qualité.