Le kit TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C_T™ permet l’analyse de l’expression directement à partir de cellules mises en culture sans purification de l’ARN. Ce kit permet de gagner du temps et offre un flux de travail simple qui est adapté à quelques échantillons ou qui peut facilement être incorporé dans des applications automatisées à haut débit.

Le kit d’expression génétique TaqMan™ Cells-to-C_T est :

• Complet : flux de travail optimisé composé de réactifs de lyse cellulaire avec élimination de l’ADNg, du mélange enzymatique RT, d’un tampon et du nouveau mélange d’expression génétique TaqMan™ Gene Expression Master Mix
• Rapide : préparation des échantillons en 7 minutes à température ambiante, y compris le traitement par DNase
• Facile : lysez des échantillons dans un tube ou directement sur des plaques de culture
• Robuste : réalisez l’analyse de l’expression génétique de 10 à 100 000 cellules par échantillon ; résultats équivalents à ceux obtenus à partir de l’ARN purifié
• Efficace : contient suffisamment de réactifs pour générer 500 résultats de PCR en temps réel à partir de 100 échantillons de départ

. Doté d’une méthode unique pour lyser les cellules cultivées tout en retirant l’ADN génomique et en préservant l’intégrité de l’ARN, le kit d’expression génétique TaqMan™ Cells-to-C_T™ contient des réactifs de transcription inverse (RT) pour la synthèse d’ADNc et le mélange TaqMan™ Gene Expression Master Mix pour l’analyse PCR en temps réel. Les ensembles d’amorces ⁄ sondes TaqMan™ sont vendus séparément.

Préparation d’échantillons simple de 7 minutes : partie d’un flux de travail complet
Que vous utilisiez des plaques ou des tubes, le kit d’expression génétique TaqMan™ Cells-to-C_T™, qui utilise la procédure simple de préparation des échantillons en 7 minutes décrite (voir illustration), est conçu pour 10 à 100 000 cellules cultivées ⁄ échantillon. Les cellules sont nettoyées dans du PBS et lysées en solution pendant 5 minutes à température ambiante ; le traitement par DNase peut être réalisé simultanément. La lyse est terminée à température ambiante par une incubation de 2 minutes avec une solution d’arrêt. Les lysats sont désormais prêts pour la transcription inverse ou une conservation à –20°C. Étant donné que les échantillons peuvent être traités directement dans des puits de culture (96 ou 384 puits), la manipulation des échantillons et le risque de perte des échantillons ou d’erreur de transfert sont minimisés, ce qui contribue à un traitement à haut débit rapide. Contrairement aux anciens protocoles d’isolement de l’ARN en plusieurs étapes, aucune étape de chauffage, nettoyage ou centrifugation n’est nécessaire. Le kit simplifie considérablement un processus laborieux de 30 à 60 minutes et le réduit à 7 minutes.

Le flux de travail du kit d’expression génétique Cells-to-C_T™ TaqMan™ permet une évaluation d’expression génétique inégalée avec l’un des > 700 000 dosages d’expression génétique TaqMan™. Ce kit a été largement testé pour sa spécificité avec une vaste sélection de dosages d’expression génétique TaqMan™ et démontre des performances équivalentes à celles obtenues avec de l’ARN purifié (voir figure).

Obtenez des performances et une sensibilité inégalées
Contrairement à certains kits concurrents qui limitent la quantité de lysat dans la réaction RT à 5 %,le kit d’expression génétique TaqMan™ Cells-to-C_T™ peut accueillir 45 % du volume total de la réaction RT sous forme de lysat cellulaire. En outre, l’ADNc peut composer jusqu’à 45 % du volume de réaction de PCR en temps réel. Le grand volume de lysat dans la réaction RT optimisée, associé à un grand volume d’ADNc lors de la PCR en temps réel subséquente qui utilise le mélange maître d’expression génétique TaqMan™, mène à une sensibilité maximale. Le Master Mix amplifie la cible de manière précise et exacte, permettant la détection de petites quantités de cible, comme des transcriptions exprimées à de faibles niveaux.

La capacité à détecter des quantités cibles limitées a été testée en mélangeant un nombre constant de cellules humaines avec différents nombres de cellules de souris. Les mélanges cellulaires ont été préparés à l’aide du kit TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C_T™ et dosés pour un gène spécifique à la souris et spécifique à l’humain. Des données comparatives ont été générées de la même manière avec de l’ARN purifié à l’aide d’une méthodologie classique. Les données indiquent que l’ARN provenant d’à peine 10 cellules de souris était détectable dans un fond d’ARN de 10 000 cellules humaines (voir la figure). La capacité du kit d’expression génétique TaqMan™ Cells-to-C_T™ à détecter les produits de la transcription en assez faible abondance était équivalente à celle de l’ARN purifié ; à des concentrations basses, sa capacité de détection était meilleure.

En outre, les performances du kit d’expression génétique TaqMan™ Cells-to-C_T™ ont été comparées aux kits de lysats concurrents et à l’ARN purifié. Des entrées de 100 à 100 000 cellules⁄réaction de lyse ont été examinées. La sensibilité du protocole du kit TaqMan™ Cells-to-C_T™ était équivalente à celle obtenue avec l’ARN purifié et était supérieure à celle des lysats concurrents (voir la figure). En outre, le manque d’inhibition à des entrées cellulaires élevées et la faible variation entre les réplicats techniques démontrent la fiabilité de cette démarche pour les études d’expression génétique à l’aide de cellules mises en culture.

Performances éprouvées, ensemble
Tous les composants du kit d’expression génétique TaqMan™ Cells-to-C_T™ ont été optimisés pour assurer des performances constantes et fiables. Cela permet d’éliminer toute conjecture liée à l’assemblage des différentes préparations d’échantillons, de la RT et des kits de PCR en temps réel. Et le kit d’expression génétique TaqMan™ Cells-to-C_T™ a été validé avec les dosages d’expression génétique TaqMan™ afin d’optimiser le processus d’assurance qualité.

Produits associés
Le kit de contrôle TaqMan™ Cells-to-C_T™ a été conçu pour être utilisé avec le kit d’expression génétique TaqMan™ Cells-to-C_T™. Ce kit contient un contrôle endogène (ACTB) pour normaliser la variabilité du chargement des échantillons et un contrôle XenoRNA™ artificiel, ainsi qu’un dosage d’expression génétique TaqMan™ correspondant pour surveiller les effets de l’inhibition de la PCR.