Le kit Ambion™ Single Cell-to-C_T™ contient un flux de travail complet validé permettant d’analyser l’expression génétique des échantillons contenant 1 à 10 cellules. Chaque kit contient des réactifs qui sont adaptés à la préparation des échantillons, la transcription inverse, la préamplification et la qPCR, et qui ont été optimisés ensemble dans un flux de travail simple pouvant être réalisé en seulement 5 étapes (voir figure).

Principales caractéristiques du produit :

• Flux de travail préoptimisé pour la RT-PCR à partir de cellules individuelles
• Sensibilité maximale de l’analyse monocellulaire
• Performances et reproductibilité supérieures aux méthodes alternatives
• Kit complet et pratique avec un protocole facile à suivre

Protocole préoptimisé améliorant grandement vos chances de succès et permettant de gagner du temps
Chaque flux de travail commence par une simple étape de préparation de vos échantillons de 7 minutes, durant laquelle les cellules sont lysées, de manière efficace et reproductible, avec un traitement minimal dans une solution compatible avec la RT-PCR en aval, sans purification nécessaire. Cette étape est suivie de l’utilisation de Superscript™ RT pour la transcription inverse, du Master Mix TaqMan™ PreAmp pour amplifier l’ADNc et du Master Mix expression génétique TaqMan™ pour la qPCR. Ces quatre étapes ont été élaborées de manière à assurer une sensibilité maximale. L’échantillon cellulaire entier est maintenu dans le même puits tout au long de la procédure, de sorte qu’il n’y ait pas de perte ou de dilution de l’échantillon du matériau limité qui pourrait affecter sa sensibilité.

Sensibilité monocellulaire
La sensibilité des résultats de la PCR en temps réel peut être affectée par le niveau d’efficacité de la préparation des échantillons, de la transcription inverse ou de l’amplification. Le kit Single Cell-to-C_T™ a été conçu de manière à aborder chacun de ces problèmes potentiels et afin de proposer une solution permettant de réaliser une analyse fiable et robuste, avec une sensibilité maximale, de l’expression génétique à partir de cellules individuelles. La détection de substances monocellulaires équivalentes à l’aide du kit Single Cell-to-C_T™ démontre une linéarité et une sensibilité appropriées des résultats de la qPCR par rapport au contrôle d’échantillons contenant 100 cellules, avec une excellente reproductibilité technique (voir figure). Comme prévu, les cellules individuelles présentent une plus grande variabilité due à leur hétérogénéité biologique inhérente. En outre, les cibles d’intérêt sont amplifiées avec précision, avant la PCR en temps réel, grâce à l’inclusion d’une étape de préamplification de l’ADNc. Cette étape essentielle permet d’amplifier le signal de manière non biaisée, élargissant ainsi le potentiel d’analyse des échantillons limités. L’optimisation de la précision et du signal d’un panneau à 96 gènes ayant recours à une étape de préamplification a été démontrée (voir figure).

Performances et reproductibilité supérieures aux méthodes alternatives
Les méthodes traditionnelles de préparation des échantillons s’appuyant sur des solvants organiques, des filtres en fibre de verre ou des billes magnétiques ne conviennent pas à l’analyse monocellulaire en raison de la perte d’échantillon par précipitation, liaison et élution incomplètes de l’ARN. En outre, la plupart des méthodes monocellulaires développées en interne, impliquant une simple ébullition des cellules lysées, ne sont pas capables de rendre inactive l’ARNase endogène afin de stabiliser les profils d’expression génétique. Cela peut entraîner un clivage chimique de l’ARN et le transfert d’inhibiteurs, y compris la contamination de l’ADN génomique, ce qui peut affecter toutes les applications de RT-qPCR. En revanche, le kit Single Cell-to-C_T™ offre une sensibilité et une reproductibilité supérieures en matière d’analyse monocellulaire par rapport aux méthodes traditionnelles de purification ou d’ébullition développées en interne (voir figure).