ADN polymérase Sequenase version 2.0

Description :
Le Sequenase™ Version 2.0 DNA Polymerase est une forme génétiquement modifiée de l’ADN polymérase T7. Contrairement à l’enzyme de type sauvage, il n’a pratiquement pas d’activité exonucléase 3’→5’. Le Sequenase Version 2.0 est hautement processif, incorpore des analogues de nucléotides (dlTP, thio-dNTP, ddNTP, etc.), n’est pas entravé par des structures secondaires et peut mener à bien la synthèse par déplacement de brin. C’est une excellente enzyme pour la méthode de Sanger. Elle est utile pour d’autres applications, notamment lorsque l’absence d’activité exonucléase associée est souhaitée.Le Sequenase Version 2.0 possède deux sous unités, l’une est la protéine de thiorédoxine E. coli (MW 12 000) et l’autre une version génétiquement modifiée de la protéine 5 du gène T7 bactériophage (MW 76 000). Les changements génétiques dans cette sous-unité (suppression de 28 acides aminés par mutagenèse in vitro) éliminent toute l’activité exonucléase mesurable sans modifier l’activité d’ADN polymérase.

Propriétés :
Poids moléculaire : Composée de deux sous unités, la protéine 5 du gène T7 (76 kDa) et la thiorédoxine E. coli
(12 kDa)
pH optimal : 7,5
Température optimale : 37°C
Exigences pour cations divalents : Mg2⁺, Mn2⁺

Pureté :
Pureté supérieure à 95 % comme déterminée par SDS-PAGE. Testée pour la contamination des endonucléases et des exonucléases double et simple brin.

Tampon de stockage :
20 mM de phosphate de potassium (pH 7,4), 1 mM de DTT, 0,1 mM d’EDTA, 50 % de glycérol.

Conditions de test :
Le mélange de réaction (100 μl) contient 40 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de MgCl₂, 5 mM de DTT, 0,3 mM de dNTP et 5 μg de M13mp18 pré-hybridé sur une amorce universelle M13 de 5 pmol. L’enzyme est ajoutée au mélange de réaction préchauffé (37°C) ; l’incubation se fait à 37°C pendant 1 min.

Définition de l’unité :
Une unité d’enzyme catalyse l’incorporation de 1 nmol de nucléotide sous forme d’acide insoluble pendant 30 s à 37°C.

Concentration :
13 unités/μl

Tampon de dilution Sequenase (1 ml inclus, réf. 70765) :
10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM de DTT, 0,1 mM d’EDTA.

Références :
Tabor, S. et Richardson, C. C. (1989) J. Biol. Chem. 264, 6447-6458.
Wang, D., Coscoy, L., Zylberberg, M., Avila, P. C., Boushey, H. A., Ganem, D. et DeRisi, J. L. (2002) Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99, 15687-15692.
Paris, M. (1992) Comments 18, (No. 3), United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio.
Tabor, S. et Richardson, C. C. (1987) Proc.Natl. Acad Sci. USA 84, 4767-4771.
Tabor, S. et Richardson, C. C. (1989) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86, 4076-4080.