HotStart-IT Binding Protein

Application
Amplification par PCR à démarrage à chaud

HotStart-IT™ Binding Protein est le composant actif d’une nouvelle technologie à démarrage à chaud appelée séquestration des amorces. En général, les méthodes PCR à démarrage à chaud réduisent ou éliminent les produits d’extension d’amorce non spécifiques formés à des températures plus basses lors de l’assemblage des réactions PCR. À ces températures de recuit moins rigoureuses, les amorces peuvent se lier de façon non spécifique, ce qui conduit souvent à des produits d’amplification indésirables et à des amorces-dimères. Afin de résoudre ce problème, nous avons produit une protéine de liaison de l’ADN de haute qualité qui est particulièrement utile à la séquestration des amorces à des températures plus basses, ce qui les rend indisponibles pour une polymérase (Fig. 1). Cette technique de séquestration des amorces bloque efficacement la synthèse de l’ADN à partir d’événements de mauvais amorçage à des températures plus basses. Après l’étape de dénaturation initiale pendant la PCR, la protéine est inactivée et les amorces sont libres de participer à la réaction d’amplification. Contrairement à d’autres méthodes à démarrage à chaud, telles que les modifications d’anticorps ou les modifications chimiques, la protéine de liaison est compatible avec une variété de polymérases thermostables. HotStart-IT Binding Protein a été conçue pour les applications PCR qui exigent une spécificité et une sensibilité extrêmement élevées et soumise à des tests rigoureux de pureté et de performances.

Propriétés
HotStart-IT Binding Protein fonctionne bien dans de nombreux tampons de réaction PCR standard.

Pureté
Exempte de nucléases non spécifiques détectables.

Tampon de stockage
Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), KCl 200 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM et glycérol 50 %.

Définition de la masse
En général, un microgramme de HotStart-IT Binding Protein séquestre environ 5 pmol d’amorces.

Concentration
10 ± 0,5 mg/ml

Source
Protéine recombinante exprimée dans E. coli.

Avantages de HotStart-IT
• Préparation de la réaction à température ambiante.
• Hautes spécificité et sensibilité
• Minimise l’amplification de produits non spécifiques et des amorces-dimères (Fig. 2)
• Idéale pour les modèles complexes et les réactions multiplexes
• Contrairement au Taq chimiquement modifié, nul besoin d’une étape de chauffage étendue qui puisse endommager les échantillons précieux
• La technologie est portative à une polymérase de choix.

Essai de contrôle qualité de blocage de la polymérase
Cet essai compare la quantité d’activité d’ADN polymérase Taq avec 2 µg de HotStart-IT Binding Protein et son activité sans protéine de liaison. Les mélanges réactionnels contiennent 0,625 unités de polymérase, un tampon de réaction PCR (10 mM de Tris-HCl [pH 8,6], 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl₂), 0,2 mM de chaque dNTP et 2 pmol d’oligonucléotides pouvant se chevaucher et extensibles dans un volume de réaction de 25 µl. Après incubation à 25°C pendant 4 heures, HotStart-IT Binding Protein bloque au moins 90 % de l’activité d’ADN polymérase Taq. (Reportez-vous à la fig. 2 pour les données représentatives.)

Test fonctionnel
Une PCR avec ADN polymérase Taq et HotStart-IT Binding Protein déplace la production d’amorces-dimères vers une cible spécifique de 306 bp à partir de 1 ng d’ADN génomique humain par rapport à l’ADN polymérase Taq seul.